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CRISPR RNAまたはcrRNAとトランス活性化crRNAまたはtracrRNAの混合物を取ります。
混合物を加熱して冷却し、tracrRNAとcrRNAの塩基対形成を促進してガイドRNA、またはgRNAを形成します。
gRNAに結合するCas9酵素と呼ばれる分子ハサミを加え、複合体を作ります。
Cas9-gRNA複合体を、エレクトロポレーション溶液に懸濁したナチュラルキラー細胞またはNK細胞に添加します。
Cas9-gRNA複合体の輸送を助ける一本鎖DNA分子を導入します。
混合物をキュベットに移し、エレクトロポレーションを行い、複合体が細胞に入るための膜に一時的な細孔を作成します。
gRNAはゲノムの標的部位に結合し、Cas9がDNAを切断できるようにします。
修復タンパク質は切断部位で結合してDNAに結合し、塩基対の挿入または欠失エラーを引き起こすことがよくあります。結果として生じる修飾により、標的遺伝子が破壊され、機能しなくなります。
遺伝子組み換え細胞を適切な培地に移して、さらなる分析を行います。
エレクトロポレーションの日に、実験細胞条件ごとに100 IUのIL-2を添加した8ミリリットルの新鮮な培地を1つのT25フラスコに充填し、フラスコを摂氏37度および5%CO2インキュベーターに加湿します。
培地が平衡化している間に、条件ごとに3〜4 x 106細胞、形質導入混合物26マイクロリットルあたりを円錐形のチューブに加え、遠心分離によって細胞をペレット化します。次に、洗浄ごとに12ミリリットルの滅菌PBSで細胞を3回洗浄し、細胞懸濁液からすべてのFBSを除去します。
細胞を洗浄している間に、各CRISPR RNAとトレーサーRNAを200マイクロモルの最終濃度に再懸濁します。各CRISPR RNA2.2マイクロリットルを、サンプルあたり200マイクロモル容量のトレーサーRNA1つと混合し、サンプルを摂氏95度で5分間加熱します。次に、サンプルを室温まで冷却し、CRISPR RNA - トレーサーRNA複合体を使用まで摂氏マイナス20度で保存します。
リボ核タンパク質複合体を形成するには、Cas9エンドヌクレアーゼを適切な対応するCRISPR RNA-トレーサーRNA複合体に30〜60秒かけて旋回させ、得られたCas9リボ核タンパク質複合体を室温で15〜20分間インキュベートします。
最後の洗浄後、Nucleofector溶液P3キットからエレクトロポレーションサプリメントの全量を加え、気泡を避けるように注意しながら、各細胞ペレットを20マイクロリットルのP3一次4D-Nucleofector溶液に再懸濁します。
各リボ核タンパク質複合体を5マイクロリットルを適切な細胞懸濁液に直ちに添加し、1マイクロリットルの100マイクロモルCas9エレクトロポレーションエンハンサーをCas9リボ核タンパク質複合体細胞ミックスに添加します。26マイクロリットルのCas9リボ核タンパク質細胞溶液をNucleocuvetteストリップの個々のウェルに移し、ストリップを軽くたたいて、サンプルが各ウェルの底を覆っていることを確認します。
次に、4D-NucleofectorシステムEN-138プログラムを開始します。形質導入の最後に、細胞を3分間休ませます。次に、80マイクロリットルの事前平衡化培地を各キュベットに加え、摂氏37度のインキュベーションで条件ごとにサンプルを1つのフラスコに穏やかに移します。