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まず、寒冷適応型インフルエンザ株の特定のウイルス必須タンパク質をコードするcDNAを運ぶ双方向プラスミドから始めます。
異なるインフルエンザ株の血球凝集素と修飾ノイラミニダーゼcDNAを含む双方向プラスミドの新しいセットを導入します。
このミックスにトランスフェクション試薬を導入し、インキュベートしてプラスミドとの複合体を形成します。
これらの複合体を培養ヒト上皮様細胞に転移して、プラスミドの細胞への侵入を可能にします。
反対の方向にある2つのプロモーターを持つ双方向プラスミドは、ウイルスタンパク質とそれに対応するRNAの産生を可能にします。
細胞を低温でインキュベートします。
ウイルスタンパク質とウイルスRNAは自己組織化して、寒冷適応組換えインフルエンザウイルスを形成し、暖かい条件では複製が減少します。
シアル酸を過剰発現するMDCK細胞と、ウイルスの付着と細胞内への侵入を可能にする修飾トリプシン酵素と重ね合わせます。
同じ温度でインキュベートして、新しいウイルスの複製と産生を誘導します。
ワクチン調製の準備が整った組換え弱毒化生インフルエンザウイルスを遠心分離して回収します。
まず、10%のウシ胎児血清と1%のペン連鎖球菌を含むDMEMを使用して、6ウェルプレートの各ウェルに100万個の293T細胞をプレーティングします。次に、ウェルあたり100マイクロリットルに十分なプラスミドトランスフェクション混合物を調製します。各プラスミドをマイクログラム混ぜ合わせ、予熱したOpti-MEM細胞培地を50マイクロリットルまでチューブに充填します。別のチューブに、トランスフェクトするプラスミドの総量に対応する2倍の量のリポフェクタミン2000を加え、Opti-MEMでチューブを50マイクロリットルまでトッピングします。
トランスフェクションミックスを細胞に加える前に、室温で30分間放置します。次に、100マイクロリットルのトランスフェクションミックスを各ウェルに加え、プレートをインキュベーターに16時間移動します。翌日、培地を0.3%BSAと1%ペン連鎖球菌を含むDMEMに変更します。そうしたら。細胞を摂氏33度まで、5%の二酸化炭素で5時間移動させます。
5時間後、トリプシンを添加したDMEMに100万個のインフルエンザ許容MDCK細胞のオーバーレイを追加します。ウイルスを生成および増幅するために、摂氏33度のインキュベーション体制下で共培養を2〜3日間維持します。その後、260 gを5分間スピンして破片を取り除き、上清を回収します。