Name: 植物の葉におけるヒストン修飾の検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: 学ぶクロマチン免疫沈降法による植物のヒストン修飾検出法。Arabidopsisを用いて、遺伝子発現制御に関わる特定のヒストン修飾を検出し、植物生理学の分子メカニズム解明に役立つ実験手法を習得できます。

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<p class="jove_content">この作品は、ドイツ科学財団（DFG）とドイツ連邦政府と州政府のエクセレンスイニシアチブによって資金を供給された。 </p>

<p class="jove_title"> 1。植物材料の架橋</p><ol><li> 50 mlのプラスチックチューブで収穫シロイヌナズナの葉の1〜2グラム（6〜10cmのロゼットの直径）と架橋のバッファと40mlのためにいっぱいに。 </li><li>葉は右側のバッファの表面上に合わせたフィルタースポンジを詰めることによって、例えば、浸漬滞在を確認してください。その後、デシケーター中にチューブを置きます。 </li><li>真空は、10分間浸潤。各チューブに架橋を停止するには2Mグリシンの2.5mLを追加し、そしてグリシンの均等分散を保証するためにチューブを反転させる。 </li><li>真空は、別の5分間に潜入し、ふるいに葉を収穫しながら液を捨てる。 </li><li>洗浄は、ガラスのビーカーの水の1L、徹底的にペーパータオルで乾燥した葉で二回葉。 </li><li>新鮮なプラスチック製のチューブで葉を収集し、液体窒素中で凍結する。店は-80葉° Cまでのクロマチンの単離。 </li></ol><p class="jove_title"> 2。クロマチンの単離</p><ol><li>葉は、使用するまで液体窒素中に保管されたモルタルと雌しべで粉砕した。 </li><li>を50 mLプラスティックチューブに粉を移し、30mLを抽出バッファー＃1で一時停止。 </li><li>オーバーヘッドシェーカー上で4℃で15分間インキュベートする。 </li><li>新鮮な50 mLのプラスチックチューブにミラクロスの4つの層を介してろ液は、懸濁液。 </li><li> 4℃で2800 × gで20分のためにスピン℃に</li><li>上清を除去し、1mLの抽出バッファー＃2のペイントブラシでペレットを懸濁する。まず、ペイントブラシでペレットを中断し、バッファの残りを追加し、バッファ＃2の小さなボリュームを追加します。 </li><li> 4℃で12,000 xgで10分間1.5mlのマイクロチューブとスピンして懸濁液を移す℃に</li><li>一方、1.5mlの抽出バッファー＃3を含む液2ml、マイクロチューブを用意する。 </li><li>紡糸管（ステップ2.7）から上清を除去し、抽出緩衝液第3位の300μLでペレットを懸濁する。最初のバッファの小さなボリュームを追加する＃3、ペイントブラシでペレットを中断し、残りのバッファを追加します。 </li><li>ステップ2.8で作成した1.5​​ mLの抽出バッファー＃3の上に慎重にピペット中断ペレットを（ステップ2.9）。二つの相が混在しないことを確認してください。 4℃で16000 × gで1時間のためにスピン℃に</li><li>上清を除去し、超音波処理のバッファの300μLでペイントブラシでクロマチンペレットを中断。 </li><li>約400bpのDNAの大きさに、sonotrodeと、または超音波浴中でクロマチンを超音波処理してください。超音波処理するときに、クロマチンは° Cは熱に敏感な架橋を保護するために約30以上に加熱されることはありませんことを確認してください。それは別の超音波デバイスの間に著しく変化するため、超音波処理の期間は、実験的に決定する必要があります。ガイダンスについては、二つの異なるデバイスの設定が用意されています： </li></ol><p class="jove_content">設定は25％の電力で0.6mL微量遠心管でBandelinブランドsonotrodeを公開クロマチ​​ンと超音波処理のための5倍〜20バースト、周期= 50。氷浴では20 <sup>番目の</sup>バーストの後に、編集作業中に、涼しいサンプル。 </p><p class="jove_content"> DiagenodeのBioruptor超音波洗浄機と超音波処理の場合は、水と氷で風呂を記入し、"高"に設定して1.5mlのマイクロチューブに30秒間十倍を超音波で分解する。毎30秒後、別の30秒間クールなサンプル。 </p><ol start="13"><li>スピンは4で16,000 gで5分間サンプルを超音波処理℃で溶解していない物質を沈殿させる。上清を直接免疫沈降に使用することができます。また、サンプルは、衝撃、液体窒素で凍結し、-80℃で保存できますさらに使用するまでのC。 </li></ol><p class="jove_title"> 3。免疫沈降</p><ol><li> 40μlのタンパク質 - 抗体 - 結合バッファーのアガロースおよび1.8mLを含む2 mLのマイクロ遠心チューブを準備します。クロマチンの調製（ステップ2.13）の200μLを追加。 </li><li>オーバーヘッドシェーカーで1時間のためのチューブをインキュベートします。 </li><li>プロテインA -アガロースビーズを破棄し、免疫沈降のために上清を使用してください。 </li><li>クロマチンの濃度を（'input'）を決定するために40μlの-アリコートを削除します。 </li><li> 30μlのプロテ​​インA -アガロースおよび400μL音波処理クロマチンの懸濁液に特異的な試薬と設備の下の表に示されている修正特異的抗体の量を追加します。 </li><li> 4時オーバーヘッドシェーカー上で2.5時間または一晩インキュベート℃に</li><li> 440 xgで2分間ビーズをスピンダウン</li><li>各洗浄バッファーの900μL（下のリストを参照）ビーズペレットを洗浄します。各バッファの場合は、4℃でオーバーヘッドシェーカーで10分間バッファーでビーズをインキュベートして、440 xgで2分間スピンし上清を捨て、そして次のバッファを追加します。 <ol><li>低塩の洗浄バッファー</li><li>高塩分洗浄バッファー</li><li> LiClを洗浄バッファー</li><li> TE洗浄バッファー</li></ol></li><li>最終洗浄後、完全に残っているバッファを削除します。 </li></ol><p class="jove_title"> 4。ヒストンとDNAの脱架橋、および沈殿したDNAの精製</p><ol><li>アガロースをペレットと40μlの"入力"のサンプル手順3.4、ボルテックスミキサーで5分のミックス、スピンのサンプルから、とincuに脱架橋バッファー100μLを加える℃で一晩65℃で脱灰する。 </li><li>市販のDNAやPCR精製キットでDNAを精製。 </li><li>通常は最後のカラム溶出液の1:5希釈の5μlのは、実行するのに十分であり、従来の遺伝子座特異的リアルタイム定量RT - PCR（RT - QPCR）。 </li></ol><p class="jove_title"> 5。バッファの表</p><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>架橋バッファ</strong> </td></tr><tr><td>酪酸ナトリウム</td><td> 10mMの</td></tr><tr><td>スクロース</td><td> 400mmの</td></tr><tr><td>トリス- HCl、pH8.0の</td><td> 10mMの</td></tr><tr><td> β-メルカプトエタノール</td><td> 5mMの</td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td><td> 3％（v / v）の</td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>抽出緩衝液第1位</strong> </td></tr><tr><td>酪酸ナトリウム</td><td> 10mMの</td></tr><tr><td>スクロース</td><td> 400mmの</td></tr><tr><td>トリス- HCl、pH8.0の</td><td> 10mMの</td></tr><tr><td> β-メルカプトエタノール</td><td> 5mMの</td></tr><tr><td>完全なプロテアーゼ阻害剤</td><td> 1X </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>抽出バッファー＃2</strong> </td></tr><tr><td>酪酸ナトリウム</td><td> 10mMの</td></tr><tr><td>スクロース</td><td> 250mmの</td></tr><tr><td>トリス- HCl、pH8.0の</td><td> 10mMの</td></tr><tr><td> β-メルカプトエタノール</td><td> 5mMの</td></tr><tr><td> MgCl <sub>2の</sub> </td><td> 10mMの</td></tr><tr><td>トリトンX - 100 </td><td> 1％（w / v）の</td></tr><tr><td>完全なプロテアーゼ阻害剤</td><td> 1X </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>抽出緩衝液第3位</strong> </td></tr><tr><td>酪酸ナトリウム</td><td> 10mMの</td></tr><tr><td>スクロース</td><td> 1.7M </td></tr><tr><td>トリス- HCl、pH8.0の</td><td> 10mMの</td></tr><tr><td> β-メルカプトエタノール</td><td> 5mMの</td></tr><tr><td> MgCl <sub>2の</sub> </td><td> 2mMの</td></tr><tr><td>トリトンX - 100 </td><td> 0.15％（w / v）の</td></tr><tr><td>完全なプロテアーゼ阻害剤</td><td> 1X </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>超音波処理のバッファ</strong> </td></tr><tr><td>トリス- HCl、pH8.0の</td><td> 25mMの</td></tr><tr><td> EDTA - NaOHで、pH8.0の</td><td> 5mMの</td></tr><tr><td> SDS </td><td> 0.5％（w / v）の</td></tr><tr><td>完全なプロテアーゼ阻害剤</td><td> 1X </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>抗体結合バッファー</strong> </td></tr><tr><td>トリス- HCl、pH8.0の</td><td> 50mmの</td></tr><tr><td> EDTA - NaOHで、pH8.0の</td><td> 1mMの</td></tr><tr><td> NaClの</td><td> 150MM </td></tr><tr><td>トリトンX - 100 </td><td> 0.1％（w / v）の</td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>低塩の洗浄バッファー</strong> </td></tr><tr><td> NaClの</td><td> 150MM </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 0.1％（w / v）の</td></tr><tr><td>トリトンX - 100 </td><td> 1％（w / v）の</td></tr><tr><td> EDTA - NaOHで、pH8.0の</td><td> 2mMの</td></tr><tr><td>トリス- HCl、pH8.0の</td><td> 20mMの</td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>高塩分洗浄バッファー</strong> </td></tr><tr><td> NaClの</td><td> 500mmの</td></tr><tr><td> SDS </td><td> 0.1％（w / v）の</td></tr><tr><td>トリトンX - 100 </td><td> 1％（w / v）の</td></tr><tr><td> EDTA - NaOHで、pH8.0の</td><td> 2mMの</td></tr><tr><td>トリス- HCl、pH8.0の</td><td> 20mMの</td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>LiClを洗浄バッファー</strong> </td></tr><tr><td>リチウム塩化</td><td> 250mmの</td></tr><tr><td>ノニデット- P40 </td><td> 1％（v / v）の</td></tr><tr><td>デソキシコール酸ナトリウム</td><td> 1％（w / v）の</td></tr><tr><td> EDTA - NaOHで、pH8.0の</td><td> 1mMの</td></tr><tr><td>トリス- HCl、pH8.0の</td><td> 20mMの</td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>TE洗浄バッファー</strong> </td></tr><tr><td> EDTA - NaOHで、pH8.0の</td><td> 10mMの</td></tr><tr><td>トリス- HCl、pH8.0の</td><td> 1mMの</td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Decrosslinkingバッファ</strong> </td></tr><tr><td>トリス- HCl、pH 6.8の</td><td> 62.5mM </td></tr><tr><td> NaClの</td><td> 200mmの</td></tr><tr><td> SDS </td><td> 2％（w / v）の</td></tr><tr><td> DTT </td><td> 10mMの</td></tr></tbody></table><p class="jove_title"> 6。代表的な結果： </p><p class="jove_content"> βをエンコードする<em>シロイヌナズナPR2</em>防御遺伝子の発現抗菌活性を持つ1,3 -グルカナーゼ<sup>12は</sup> 、ベンゾチアジアゾール（BTH）、植物ホルモンであるサリチル酸<sup>3</sup>の合成アナログで誘導した。 <strong>図1は<em>、PR2</em></strong>の発現の活性化は、ヒストンのリジン残基のアセチル化の増加に関連付けられている実証<em>PR2</em>プロモーター上のH3とH4。ヌクレオソーム密度が遺伝子の活性化<sup>は13</sup>減少するため、ヒストンアセチル化の値は、ヒストン3の不変領域に対する抗体を用いて得られた信号のために標準化した。 </p><p class="jove_content"><img src="/files/ftp_upload/3096/3096fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"><br> <strong>図1 BTHは、シロイヌナズナの<em>PR2</em>プロモーターのヒストンアセチル化を誘導する</strong> 。植物は100μMBTHまたは水和剤のコントロールで処理した。 72時間後、葉を採取し、クロマチンを単離した。アセチル化 - 特異的抗体（図に示される）で沈殿後に得られた信号は、ヒストンH3の不変ドメインに対する抗体で沈殿させることにより得られる信号に対して標準化した。沈殿したクロマチンは、RT -定量PCRにより定量した。データは、BTHの治療がない場合のヒストン修飾のレベルの標準化されています。 </p>

<ol><li>Eberharter, A., Becker, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation%3A+a+switch+between+repressive+and+permissive+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+rep%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin.</a> <em>EMBO rep</em>. <strong>3</strong>, 224-229 (2002).</li>
<li>Ruthenburg, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+of+lysine+4+on+histone+H3%3A+intricacy+of+writing+and+reading+a+single+epigenetic%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Methylation of lysine 4 on histone H3: intricacy of writing and reading a single epigenetic.</a> <strong>25</strong>, 15-30 (2007).</li>
<li>Jaskiewicz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modification+acts+as+a+memory+for+systemic+acquired+resistance+in+the+plant+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+rep%22%5BJournal%5D)">Chromatin modification acts as a memory for systemic acquired resistance in the plant stress response.</a> <em>EMBO rep</em>. <strong>12</strong>, 50-55 (2011).</li>
<li>Ng, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordered+histone+modifications+are+associated+with+transcriptional+poising+and+activation+of+the+phaseolin+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Ordered histone modifications are associated with transcriptional poising and activation of the phaseolin promoter.</a> <em>Plant Cell</em>. <strong>18</strong>, 119-132 (2006).</li>
<li>Offermann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illumination+is+necessary+and+sufficient+to+induce+histone+acetylation+independent+of+transcriptional+activity+at+the+C4-specific+phosphoenolpyruvate+carboxylase+promoter+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Illumination is necessary and sufficient to induce histone acetylation independent of transcriptional activity at the C4-specific phosphoenolpyruvate carboxylase promoter in maize.</a> <em>Plant Physiol</em>. <strong>141</strong>, 1078-1088 (2006).</li>
<li>Deng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+histone+acetyltransferase+AtHAC1+in+the+regulation+of+flowering+time+via+repression+of+FLOWERING+LOCUS+C+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Involvement of the histone acetyltransferase AtHAC1 in the regulation of flowering time via repression of FLOWERING LOCUS C in Arabidopsis.</a> <em>Plant Physiol</em>. <strong>143</strong>, 1660-1668 (2007).</li>
<li>Benhamed, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+GCN5%2C+HD1%2C+and+TAF1%2FHAF2+interact+to+regulate+histone+acetylation+required+for+light-responsive+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis GCN5, HD1, and TAF1/HAF2 interact to regulate histone acetylation required for light-responsive gene expression.</a> <em>Plant Cell</em>. <strong>18</strong>, 2893-2903 (2006).</li>
<li>Bowler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+techniques+for+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Chromatin techniques for plant cells.</a> <em>Plant Journal</em>. <strong>39</strong>, 776-789 (2004).</li>
<li>Orlando, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+chromosomal+proteins+in+vivo+by+formaldehyde+decrosslinked-chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde decrosslinked-chromatin immunoprecipitation.</a> <em>Trends Biochem. Sci</em>. <strong>25</strong>, 99-104 (2000).</li>
<li>Haring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation%3A+optimization%2C+quantitative+analysis+and+data+normalization%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Meth%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization.</a> <em>Plant Meth</em>. <strong>3</strong>, 11-11 (2007).</li>
<li>Danker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+information+but+not+promoter+activity+controls+the+methylation+state+of+histone+H3+lysine+4+on+two+photosynthetic+genes+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Developmental information but not promoter activity controls the methylation state of histone H3 lysine 4 on two photosynthetic genes in maize.</a> <em>Plant J</em>. <strong>53</strong>, 465-474 (2008).</li>
<li>Uknes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquired+resistance+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Acquired resistance in Arabidopsis.</a> <em>Plant Cell</em>. <strong>4</strong>, 645-656 (1992).</li>
<li>Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+displacement+in+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Develop%22%5BJournal%5D)">Nucleosome displacement in transcription.</a> <em>Genes Develop</em>. <strong>20</strong>, 2009-2017 (2006).</li>
</ol>

<p class="jove_content">利害の衝突は宣言されません。 </p>

<p class="jove_content">プロトコルにおいて最も重要なステップは、材料の研削、およびクロマチンの超音波処理、DNAとヒストン、型と葉の物質の量の架橋です。これらの問題についての詳細は、refsを参照してください。 9と10。 </p><p class="jove_step">超音波処理と架橋： </p><p class="jove_content"> 400bp程度の断片に超音波照射時のクロマチンを妨害することが重要です。不十分な超音波処理が長いクロマチンの断片を残すのに対し、徹底的な超音波処理は、DNAとヒストンを破壊することによりクロマチンを破壊します。テストした軌跡から遠位ヒストン修飾がローカルの変更と区別できないため、これらは、メソッドの特異性に影響を与えます。超音波処理の効率が最高のDNAを単離し、アガロースゲル電気泳動により断片化したDNAの長さを決定する、超音波処理、脱架橋DNAとヒストンの前と後のサンプルから20μLクロマチンを収集することによってテストされています。クロマチンの準備がまだ断片化したDNAの可視化を妨げる可能性のある精製のこの段階でRNAを大量に含まれているため、RNアーゼは、電気泳動前のサンプルに追加する必要があります。非断片化したクロマチンからDNAが10kbp以上の場合、断片化したクロマチンからDNAは、DNAの400bp前後の最大信号強度とスミアを形成するのに対し、サンプルは、クロマチン免疫沈降のために有用です。 </p><p class="jove_content">我々は日常的に無傷の葉におけるクロマチン架橋のために3％（v / v）のホルムアルデヒドを使用していますが、1％（v / v）のホルムアルデヒドは、ほとんどのケースで十分な場合があります。私たちの手では、低ホルムアルデヒドの濃度が短い超音波処理時間とそれに伴うPCR反応のバックグラウンドシグナルを可能にする。しかし、ホルムアルデヒドの不十分な量は、しばしば独立した実験の間でPCR信号の低再現性につながる。これは、低濃度でホルムアルデヒドと葉の不十分な浸透に起因するかもしれない。化合物が時間とともに重合する傾向があるので頻繁にホルムアルデヒドの株式を交換することを確認してください。ホルムアルデヒドのソリューションは、約一ヶ月間安定しており、この期間はほとんどメタノールの安定化によって延長されていません。それは、実験条件を設定するときに別のホルムアルデヒド濃度をテストすることをお勧めします。 </p><p class="jove_step">植物材料の量と研削： </p><p class="jove_content">お互いに付着葉を避けるために、バッファの大量の葉材料の少量に潜入することが重要です。葉は、しばしば、ホルムアルデヒドの不十分な浸潤の結果を突き出し。また、あまりにも多くの植物材料は、ミラクロス組織の細孔をブロックします。粉砕効率が大幅に完璧にフィットで乳鉢と乳棒を使用してによって異なります。材料を微粉末に粉砕されるまで、我々は定期的に追加の液体窒素の欠如50秒間、3回の液体窒素冷却乳棒と乳鉢を用いて挽く。 </p>

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td>プロテイン- A -アガロース</td><td>ロッシュ</td><td> 11 134 515 001 </td><td>抗体のクラスによって異なります。 </td></tr><tr><td>プロテイン- G -アガロース</td><td>ロッシュ</td><td> 11 243 233 001 </td><td>抗体のクラスによって異なります。 </td></tr><tr><td>抗hyperacetyl - H4 </td><td>ミリポア</td><td> 06から946 </td><td>我々は、5μLを用い</td></tr><tr><td>抗アセチル- H4K5 </td><td>ミリポア</td><td> 07から327 </td><td>我々は、5μLを用い</td></tr><tr><td>抗アセチル- H4K8 </td><td>ミリポア</td><td> 07から328 </td><td>我々は、5μLを用い</td></tr><tr><td>抗アセチル- H4K12 </td><td>ミリポア</td><td> 07から595 </td><td>我々は、5μLを用い</td></tr><tr><td>抗アセチル- H4K16 </td><td>ミリポア</td><td> 07から329 </td><td>我々は、5μLを用い</td></tr><tr><td>抗アセチル- H4K18 </td><td>ミリポア</td><td> 07から354 </td><td>我々は、1μLを用い</td></tr><tr><td>抗アセチル- H3K9 </td><td>ミリポア</td><td> 07から352 </td><td>我々は、5μLを用い</td></tr><tr><td>抗アセチル- H3K14 </td><td>ミリポア</td><td> 07から353 </td><td>我々は、1μLを用い</td></tr><tr><td>抗トリメチル- H3K4 </td><td> Diagenodeの</td><td> PAB - 003から50 </td><td>我々は、5μLを用い</td></tr><tr><td>抗ジメチル- H3K4 </td><td>ミリポア</td><td> 07から030 </td><td>我々は、5μLを用い</td></tr><tr><td>抗モノメチル- H3K4 </td><td>アブカム</td><td> ab8895 </td><td> 2,5 -10μL </td></tr><tr><td>抗H3 </td><td>アブカム</td><td> ab1791 </td><td>我々は、ヒストンの密度を確認するために1μLを用い</td></tr><tr><td> Bioruptor </td><td> Diagenodeの</td><td> UCD - 200に</td><td></td></tr><tr><td> Sonotrode MS72 </td><td> Bandelin </td><td></td><td></td></tr><tr><td>ミラクロス</td><td>カルビオケム</td><td> 475855 </td><td></td></tr><tr><td>完全なプロテアーゼ阻害剤</td><td>ロッシュ</td><td> 11836145001 </td><td></td></tr></tbody></table>

植物の葉におけるヒストン修飾の検出

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

<p class="jove_content">クロマチン構造は、真核生物における遺伝子発現の調節に重要である。このプロセスでは、ヒストンH3およびH4のアミノ末端尾部でのクロマチンリモデリング、DNAメチル化、および共有結合修飾は、本質的な役割<sup>1〜2</sup>果たす。 H3およびH4ヒストン修飾は、リジンやアルギニンのメチル化、リジンのアセチル化、および<sup>1-2</sup>のセリン残基のリン酸化が含まれています。これらの修飾は遺伝子の活性化、抑制、または適切な信号（微生物体関連分子パターン、光、ホルモン、等<sup>）3-7</sup>の認識の後の式のより迅速かつ堅牢な活性化をサポートしている遺伝子のプライミング状態のいずれかで関連付けられています。 </p><p class="jove_content">ここでは、選択された植物遺伝子上の特定のクロマチン修飾の信頼性と感度に検出する手法を提案する。技術は、特異的修飾抗体<sup>9,10、</sup>ヒストン- DNA複合体の脱架橋、とクロマチン、クロマチン免疫沈降（ChIP）の抽出及び超音波処理、ホルムアルデヒド<sup>8,9</sup>付き（修正）ヒストンとDNAの架橋に基づいており、遺伝子特異的リアルタイム定量PCR。アプローチは、トウモロコシ<sup>5,11</sup>およびシロイヌナズナ<sup>3</sup>の全身性免疫におけるC <sub>4</sub>光合成に関連する特定のヒストン修飾を検出するために役立っています。 </p>

<p class="jove_content">特定の植物遺伝子上にヒストン修飾を検出するために信頼性の高い有用なアプローチが説明されています。アプローチは、クロマチン免疫沈降（ChIP）とリアルタイム定量PCRを兼ね備えています。それは、多様な生理学的プロセスにおいて役割を持つ特定の遺伝子のヒストン修飾の検出を可能にする。</p>

クロマチン構造は、真核生物における遺伝子発現の調節において重要です。この過程において、クロマチンリモデリング、DNAメチル化、および共有結合的な...

<p>以下の手法により、選択した植物遺伝子における特定のクロマチン修飾を高感度かつ信頼性高く検出することが可能です。まず、ホルムアルデヒドを用いて修飾ヒストンとDNAを架橋します。次に、クロマチンを抽出し、ソニケーションを行うことで、修飾特異的抗体による免疫沈降を容易にします。</p><p>最後に、ヒストンDNA複合体のクロスリンクと遺伝子特異的リアルタイム定量PCRによって、ChIP反応を分析します。植物において、この手法は、トウモロコシのC4光合成やシロイヌナズナの全身性免疫に関連する特定のヒストン修飾など、分子レベルでの知見を提供できます。質量分析法などの既存の手法に対するクロマチン免疫沈降法の主な利点は、この技術によって植物ゲノム内の選択された配列上のヒストン修飾を検出できることです。</p><p>一般的に、この手法を初めて行う方は苦労することがあります。なぜなら、本プロトコルには手順の成功に不可欠な、正確な操作が求められるステップがいくつか含まれているためです。このビデオでは、モデル植物Arabidopsis ANAにおける遺伝子発現の調節不全に関する知見を得るためにChIP解析を用います。手順の実演は、博士課程の学生であるmic yakovichが行います。各サンプルについて、まず2 gのArabidopsisの葉を採取し、50 mLのプラスチックチューブを用意します。40 mLの目盛りまで架橋バッファーを満たし、葉が確実に浸ったままになるよう、バッファー表面の直上に誂えたフィルタースポンジを配置します。</p><p>次に、サンプルを真空デシケーターに入れ、10分間浸透させます。架橋反応を停止させるため、2 Mのグリシンを2.5 mL加え、転倒混和します。その後、さらに5分間浸透させ、真空状態でさらに5分間浸透させます。</p><p>その後、ふるいを用いて葉を回収しながら、液体を捨てます。プラスチックビーカーに入れた1 Lの水で葉を2回洗浄した後、ペーパータオルで葉を十分に拭き取り、新しいプラスチックチューブに回収して液体窒素中で凍結させます。クロマチン単離まで、サンプルを-80 °Cで保存してください。</p><p>液体窒素で冷却した乳鉢と乳棒を用いて、凍結試料を微粉末になるまで粉砕します。粉末を50 milliliterのプラスチックチューブに移します。粉末を30 millilitersの抽出緩衝液1に懸濁させ、オーバーヘッドシェーカーを用いて4 °Cで15分間インキュベートします。</p><p>懸濁液を4層のミラークロスを通して、新しい50 milliliterのプラスチックチューブにろ過します。遠心分離後、上清を捨てます。次に、絵筆を用いてペレットを50 microlitersの抽出バッファー2に再懸濁し、さらに950 microlitersの抽出バッファーを加えます。</p><p>2番目に、懸濁液を1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、10分間遠心分離します。その間に、1.5 mLの抽出バッファーを入れた2 mLマイクロ遠心チューブを準備します。3番目に。</p><p>次に、上清を取り除き、抽出バッファー 300 µL でペレットを徐々に懸濁させます。手順3です。まず、少量のバッファーを加えます。</p><p>3番目に、ペレットを絵筆で懸濁させ、残りのバッファーを加えます。次に、あらかじめ準備しておいた1.5 mLの抽出バッファーが入ったチューブの上に、サンプルを慎重に重層させます。3番目に、2つの相が混ざらないように注意しながら、サンプルを4 °Cで16,000 ×gにて1時間遠心分離します。</p><p>上清を除去し、クロマチンペレットをペイントブラシを用いて300 µLのソニケーションバッファーで懸濁させ、DNAサイズが約400 bpになるまでクロマチンをソニケーションします。ソニケーションの際は、クロマチンの温度が約30 °Cを超えないように注意してください。熱に不安定なクロスリンクを保護するため、ソニケーション後のサンプルを遠心分離して未溶解物を沈殿させ、その上清をプロテインアガロースおよび抗体結合バッファーを含む2 mLマイクロ遠心チューブに回収します。</p><p>調製したクロマチンサンプルを 200 µL 加えます。チューブをオーバーヘッドシェーカーで 1 時間インキュベートします。遠心分離後、サンプルの上清を回収し、タンパク質を 30 µL ずつ分注します。</p><p>投入材料のクロマチン濃度を測定するため、新しい1.5 mLチューブを用意します。超音波処理したクロマチンのうち40 µLを分取しておきます。次に、超音波処理したクロマチン懸濁液400 µLを、30 µLのプロテインAビーズおよび適切な量の修飾特異的抗体が加えられたチューブに添加し、オーバヘッドシェーカーを用いて4 °Cで一晩インキュベートします。</p><p>440 ×gで2分間遠心分離し、ビーズを回収します。上清を除去し、オーバーヘッドシェーカーを用いて、各バッファー900 µLでビーズペレットを10分間の洗浄で繰り返し洗います。最終洗浄後、残っているバッファーを完全に除去します。DNAをヒストンから遊離させるため、ビーズにD cross linking buffer 400 µLと、先に保存しておいた40 µLのインプットサンプルを加え、5分間ボルテックスし、サンプルを遠心分離した後、65 °Cで一晩インキュベートします。</p><p>次に、市販のDNA精製キットを用いてDNAを精製し、従来の遺伝子座特異的リアルタイム定量R-T-P-C-Rを行います。この例では、植物ホルモンであるサリチル酸の合成アナログであるBenzo Diaz oleにより、Arabidopsis ANA PR two防御遺伝子の発現を誘導しました。結果は、PR two発現の活性化が、PR twoプロモーター上のヒストンH3およびH4のリシン残基のアセチル化増加に関連していることを示しています。</p><p>この手順を行う際は、葉粉末に抽出バッファー1を加えると、密閉されたfconチューブ内で過剰圧力が生じることに注意してください。適宜、チューブの蓋を開けるようにしてください。また、ペレットを懸濁させた後、次のバッファーを加える前にペイントブラシを取り出さないでください。</p><p>このビデオを視聴することで、ホルムアルデヒドを用いたDNAとヒストンの架橋、クロマチン免疫沈降の分離、および遺伝子座特異的なDNA定量を行い、ヒストンの修飾を決定し、植物生物学のさまざまな分野におけるクロマチンとその修飾の役割に関する重要な疑問に答える方法について、十分に理解することができるはずです。</p>

detection-of-histone-modifications-in-plant-leaves

Research

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Biology

生物学

ここでは植物性タンパク質複合体の精製および特性評価のためのプロトコルを記述します。私たちは、複雑な内部に単一のタンパク質を免疫沈降によって、私たちはその翻訳後修飾とその相互作用パートナーを識別できることを実証している。...

植物タンパク質複合体の翻訳後修飾の同定

私たちは、免疫染色、蛍光in situハイブリダイゼーション 、ホールマウントシロイヌナズナ胚珠の量的、高分解能イメージングに続いてDNA染色のためにここに効率的で信頼性の高いプロトコルを提供する。この方法は、正常なクロマチン修飾および核構造を分析するために使用した。...

ホールマウント胚珠内でのクロマチン修飾や核構造の定量的、単一細胞分析のための効率的な方法<em&gt;シロイヌナズナ</em

クロマチン免疫沈降は、DNAは、インビボでのシロイヌナズナのタンパク質の結合部位を同定するための強力な技術です。この手順は、クロマチン架橋および断片化、目的のタンパク質に対する選択的な抗体を用いた免疫沈降、および結合したDNAの定量PCR分析を含みます。私たちは、シロイヌナズナ植物用に最適化され、単純なChIPアッセイを説明します。...

シロイヌナズナタンパク質-DNA相互作用の同定のための免疫沈降アッセイクロマチン<em&gt;インビボ</em

このプロトコルは、質量分析（MS）を用いて、ヒストンの翻訳後修飾を特徴付けるための完全に統合されたワークフローの概要を説明します。ワークフローは、ナノ流液体クロマトグラフィーおよびデータ分析のための命令を使用して、細胞培養物または組織、ヒストン誘導体、消化、MS分析から、ヒストンの精製を含みます。 3日 - プロトコルは2以内に完了するために設計されています。...

ヒストンの抽出からデータ解析まで：ボトムアップ質量分析法を用いてヒストンの翻訳後修飾の解析のための完全なワークフロー

このプロトコルは、エンジニアリングの干ばつ耐性作物を支援するための潜在的なエピジェネティックマーカーとして機能するヒストン翻訳後修飾のプロファイリングのために、ソルガム葉材料から無傷のヒストンを効果的に抽出するために開発されました。...

潜在的エピジェネティックマーカーのトップダウン質量分析プロファイリングのためのソルガム葉組織からのヒストンの分離

ここでは、M.オリザエおよび他の糸状菌の病因における新しい標的遺伝子を同定することができるヒストン修飾のゲノム全体の分布を分析するプロトコルを提示する。...

<em>マグナペアテオリザ</em>エにおけるクロマチン免疫沈降シーケンシング法を用いたヒストン修飾分布のゲノム解析

標的下での切断とタグ付け(CUT&amp;Tag)は、効率的なクロマチンエピゲノムプロファイリング戦略です。このプロトコルは、植物におけるヒストン修飾のプロファイリングのための洗練されたCUT&amp;Tag戦略を提示する。...

標的下およびタグ付け下での切断を用いた植物におけるH3K4me3修飾のプロファイリング

このプロトコルは、3次元細胞培養システムを使用して、ほぼ生理学的状態のクロマチン修飾をモデル化、処理、および分析する方法を概説しています。...

肝組織の3D細胞培養モデルにおけるヒストン翻訳後修飾のグローバルレベルの定量化

蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)は、生細胞におけるタンパク質相互作用を検出するためのイメージング技術です。ここでは、ヒストン修飾酵素と、植物組織における遺伝子発現のエピジェネティックな調節のためにそれらを標的プロモーターに動員する転写因子との関連を研究するためのFRETプロトコルが提示されています。...

蛍光共鳴エネルギー移動による <em>生体内</em> におけるヒストン修飾酵素と転写因子の相互作用の解明

液体クロマトグラフィー、トラップ型イオンモビリティー分光、飛行時間型質量分析(LC-TIMS-ToF...

液体クロマトグラフィー、トラップ型イオンモビリティー分光分析、飛行時間型質量分析を用いたヒストン修飾スクリーニング(英語)

このプロトコルは、同じサンプル内で植物イオン漏れ、ペルオキシダーゼ活性、カロース生成を評価するためのハイスループットアプローチを記述しています。...

高スループット形式を用いた微生物二次代謝物に対する葉の応答評価

学ぶクロマチン免疫沈降法による植物のヒストン修飾検出法。Arabidopsisを用いて、遺伝子発現制御に関わる特定のヒストン修飾を検出し、植物生理学の分子メカニズム解明に役立つ実験手法を習得できます。

植物の葉におけるヒストン修飾の検出

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