植物の葉におけるヒストン修飾の検出

特定の植物遺伝子上にヒストン修飾を検出するために信頼性の高い有用なアプローチが説明されています。アプローチは、クロマチン免疫沈降（ChIP）とリアルタイム定量PCRを兼ね備えています。それは、多様な生理学的プロセスにおいて役割を持つ特定の遺伝子のヒストン修飾の検出を可能にする。

以下の方法は、選択した植物遺伝子上の特定のクロマチン修飾を信頼性と感度で検出します。まず、修飾されたヒストンとDNAをホルムアルデヒドで架橋します。次に、クロマチンを抽出して超音波処理し、修飾特異的抗体による免疫沈降を促進します。

最後に、ヒストンDNA複合体のドロス結合と遺伝子特異的なリアルタイム定量PCRによるチップ反応を解析します。植物では、このアプローチにより、迷路におけるC 4光合成に関連する特異的なヒストン修飾やシロイヌナズナにおける全身免疫などの分子的洞察を得ることができます。火星分光法のような既存の方法に対するクロマチン免疫沈降法の主な利点は、この技術により、植物ゲノムへの選択された配列のヒストン修飾を検出できることです。

一般に、この方法に不慣れな個人は、プロトコルが手順の成功の鍵となる正しいパフォーマンスを持ついくつかのステップを伴うため、苦労するでしょう。このビデオでは、チップ分析を使用して、モデル植物シロイヌナズナANAの遺伝子発現の調節解除に関する洞察を提供し、手順を実証します マイク・ヤコビッチ、博士課程の学生 各サンプルは、シロイヌナズナの葉の2グラムと50ミリリットルのプラスチックチューブの収穫から始まります。40ミリリットルのマークに架橋バッファーを充填し、オーダーメイドのフィルタースポンジをバッファー表面の真上に置いて、葉が浸漬したままになるようにします。

次に、サンプルを真空で乾燥させ、10分間濾液にします。架橋反応を停止するには、2.5ミリリットルの2モルグリシンを加え、反転して混合します。その後、再び5分間潜入し、掃除機をかけ続け、さらに5分間潜入します。

次に、ふるいで葉を収穫しながら液体を捨てます。プラスチックビーカーで1リットルの水で葉を2回洗った後、ペーパータオルで葉を十分に乾かし、葉を新しいプラスチックチューブに集めて液体窒素で凍結します。クロマチン単離までサンプルをマイナス80°Cで保存します。

液体窒素冷却乳鉢と乳棒を使用して、凍結したサンプルを微粉末に粉砕します。粉末を50ミリリットルのプラスチックチューブに移します。粉末を30ミリリットルの抽出緩衝液番号1に懸濁し、オーバーヘッドシェーカーで摂氏4度で15分間インキュベー

サスペンションを4層のミラークロスに通し、新しい50ミリリットルのプラスチックチューブに入れます。遠心分離後、SUPナチンを廃棄してください。次に、ペイントブラシを使用して、ペレットを50マイクロリットルの抽出バッファー番号2に再懸濁し、次にさらに950マイクロリットルの抽出バッファーを追加します。

その2、懸濁液を1.5ミリリットルのマイクロフージチューブに移し、10分間遠心分離します。その間、抽出緩衝液の1.5ミリリットルを含む2ミリリットルのマイクロフュージチューブを準備します。3番です。

次に、上清を捨てて、ペレットを300マイクロリットルの抽出バッファーに徐々に懸濁します。3番です。まず、少量のバッファーを追加します。

3つ目は、ペレットを絵筆で吊るし、残りのバッファーを追加します。次に、1.5ミリリットルの抽出バッファーの準備したチューブの上にサンプルを慎重に重ねます。3つ目は、2つのフェーズが摂氏4度でGの16,000倍で1時間遠心分離サンプルを混合しないようにすることです。

sup natinを廃棄し、クロマチンペレットをペイントブラシで300マイクロリットルの超音波処理バッファーに懸濁し、クロマチンを約400塩基対のDNAサイズに冷却します。超音波処理するときは、クロマチンが摂氏約30度以上に加熱されないように注意してください。熱に敏感な架橋を保護するために、超音波処理サンプルを遠心分離して未解決物質を沈殿させ、上清をタンパク質アガロースと抗体結合緩衝液を含む2ミリリットルのマイクロフュージチューブに回収します。

200マイクロリットルのサンプルクロマチン調製物を加えます。オーバーヘッドシェーカーでチューブを1時間インキュベートします。遠心分離後、サンプル上清を回収し、30マイクロリットルのタンパク質を分注します。

A は、インプット材料のクロマチン濃度を測定するための新鮮な 1.5 ミリリットルチューブを使用します。超音波処理されたクロマチンを40マイクロリットル予約します。次に、400マイクロリットルの超音波処理クロマチン懸濁液を30マイクロリットルのタンパク質arosに加え、適量の修飾特異的抗体を摂氏4度のオーバーヘッドシェーカーで一晩インキュベートします。

清を取り除き、オーバーヘッドシェーカーでそれぞれのバッファーの900マイクロリットルでビーズペレットを連続して10分間洗浄し、G.440倍で2分間の化によってビーズを収穫します。最終洗浄後、残っているバッファーを完全に取り除きます。ヒストンからDNAを遊離させるには、ビーズに400マイクロリットルのD架橋バッファーを加え、以前にボルテックスで保存した40マイクロリットルのインプットサンプルを5分間遠心分離サンプルに加え、摂氏65度で一晩インキュベートします。

次に、市販のDNA精製キットでDNAを精製し、従来の遺伝子座特異的なリアルタイム定量R-T-P-C-Rを実行します。この例では、シロイヌナズナのANA PRの2つの防御遺伝子の発現は、植物ホルモンの合成類似体であるサリチル酸であるベンゾジアズオレによって誘導されました。結果は、PR 2発現の活性化が、PR 2プロモーター上のヒストンH 3およびH 4上のリジン残基のアセチル化の増加と関連していることを示しています。

この手順を試みる際には、抽出バッファー1をリーフパウダーに添加すると、閉じたfconチューブに過圧が発生することを覚えておくことが重要です。たまにはチューブを開けることを忘れないでください。また、ペレットを懸濁した後、次のバッファーを追加する前にペイントブラシを取り外さないように注意してください。

このビデオを見れば、ヒソン修飾と、DNAとヒストンのアルデヒドベースの架橋を形成する単純なレバー、クロマチン免疫沈降の単離、遺伝子座特異的DNA定量を決定する方法についてよく理解でき、植物生物学のさまざまな分野でのクロマチンとその修飾の役割に関する重要な質問に答えることができます。