腫瘍特異的CAR-T細胞の抗腫瘍活性を評価するためのin vitroアッセイ

B細胞特異的表面抗原と細胞質ルシフェラーゼ酵素を発現するB細胞リンパ腫腫瘍細胞を含むマルチウェルプレートを取ります。

CAR T細胞を選択したウェルに導入し、インキュベートします。細胞はキメラ抗原受容体(CAR)を発現し、腫瘍抗原を標的とする細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを含む。

CAR は腫瘍抗原に結合し、CAR T 細胞の活性化を誘導します。

活性化された細胞は、細胞の抗腫瘍活性を促進するサイトカインを放出し、毒素の放出を引き起こします。

毒素は腫瘍細胞に入り、細胞死を誘発します。

細胞をスピンダウンし、上清を分離します。サイトカインを定量化して、CAR T細胞の活性を評価します。

生物発光基質であるルシフェリンを含む緩衝液に細胞を再懸

濁します。

侵入すると、ルシフェリンは生きた腫瘍細胞のルシフェラーゼによって酸化され、発光します。

生物発光を測定して、処理された腫瘍細胞のシグナルの減少を特定し、CAR T細胞を介した細胞毒性を確認します。

まず、ルシフェラーゼ発現の有無にかかわらず、10,000個の同系標的CD19陽性腫瘍細胞と100マイクロリットルのTCMを96ウェルU底組織培養プレートの各ウェルに播種します。10,000個のCD19 CAR T細胞と100マイクロリットルのTCMを各ウェルに加えます。

テキストプロトコルで説明されているようにコントロールを設定します。細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素と16〜24時間共培養します。この後、プレートを500倍gで5分間遠心分離します。上清を採取して、インターフェロンガンマおよびインターロイキン-12 p70 ELISA分析を行います。

細胞ペレットをルシフェリンを含む100マイクロリットルのPBSに再懸濁し、摂氏37度で10分間インキュベートします。次に、ルミノメーターを使用して各ウェルからの発光を測定します。