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ナチュラルキラー(NK)細胞とがん細胞を含むマルチウェルプレートを取ります。コントロールウェルにはがん細胞のみが含まれています。
細胞との接触を容易にする遠心分離機。
インキュベート。NK細胞上の活性化受容体は、がん細胞表面リガンドに結合し、NK細胞が細胞傷害性分子を含む顆粒を放出するきっかけとなります。
これらの分子はがん細胞膜細孔を作り、アポトーシスを誘導して乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)などの細胞内内容物を放出します。
コントロールウェル内のがん細胞を溶解する界面活性剤を加えて、LDHの放出を最大化します。
LDH含有上清の一部を遠心分離し、アッセイプレートに移します。
アッセイ試薬を加えてインキュベートします。
LDHは乳酸をピルビン酸に還元NAD+に変換します。ジアホラーゼはNADHを使用してテトラゾリウム塩を還元し、赤色のホルマザン生成物を形成します。
酸性溶液を加えて酵素反応を止めます。
マイクロプレートリーダーを使用して、ウェル内のホルマザン吸光度を測定します。
ホルマザンの強度は、試験井戸で溶解したがん細胞の数に比例し、がん細胞に対するNK細胞の細胞毒性を示しています。
まず、丸底培養処理された96ウェルプレートを入手し、テキストプロトコルの表1に概説されているようにセットアップします。アッセイプレートを250回gで4分間遠心分離し、エフェクター細胞と標的細胞が接触していることを確認します。次に、プレートを摂氏37度の加湿チャンバー内で5%二酸化炭素で5時間インキュベートします。
上清を採取する45分前に、10マイクロリットルの10x溶解液を標的細胞の最大LDH放出ウェルに加え、プレートを加湿チャンバーに戻します。インキュベーションが完了したら、プレートを250倍gで4分間遠心分離します。次に、マルチチャンネルピペッターを使用して、すべてのウェルから50マイクロリットルのアリコートを新しい96ウェル平底アッセイプレートに移します。
アッセイプレートの各ウェルに50マイクロリットルのアッセイ試薬を加えます。プレートをホイルで覆って光から保護し、室温で30分間インキュベートします。この後、各ウェルに50マイクロリットルの停止溶液を追加します。停止液を添加してから1時間以内にプレートを読み取り、490ナノメートルでの吸光度を記録してください。