抗原特異的CAR-T細胞の作製技術

組

換えフィブロネクチンフラグメントでコーティングされたマイクロウェルプレートを取り、活性化されたマウスCD8陽性T細胞を加えます。

キメラ抗原受容体またはCARをコードするトランスジェニックRNAを含むレトロウイルスベクターを導入します。

プレート

を覆い、汚染を避けるために袋に密封してください。プレートを低速で遠心分離して、ウイルスと細胞の相互作用を促進します。

フィブロネクチンはウイルスと細胞に結合し、それらを共局在化してウイルスを介した遺伝子導入を促進します。

遠心分離後、密封されたバッグを取り出し、生理学的条件下でプレートをインキュベートします。

ウイルスベクターのエンベロープは細胞膜と融合し、ウイルスのRNAと酵素を放出します。

ウイルス酵素は放出されたRNAを逆転写し、得られたDNAを宿主ゲノムに組み込んで、細胞が表面結合CARを発現できるようにします。

CARは、標的抗原に特異的な抗原結合ドメインとT細胞活性化のシグナル伝達ドメインで構成されています。

抗原特異的CAR T細胞は、下流のアッセイの準備が整いました。

1日目に、24ウェルプレートのウェルに0.5ミリリットルのフィブロネクチンを加え、摂氏4度で一晩インキュベートすることにより、ヒトフィブロネクチンフラグメントコーティングプレートを調製します。

翌日、フィブロネクチン溶液を取り出し、ウェルあたり1ミリリットルの2%BSAをPBSに加えます。プレートを室温で30分間インキュベートし、処理したウェルを1ミリリットルの滅菌PBSで洗浄します。洗浄液を除去した後、プレートを使用する準備が整います。

トリパンブルーを使用して活性化されたCD8 T細胞をカウントします。遠心分離によってそれらを収集し、形質導入のために1ミリリットルあたり500万個の生細胞に再懸濁します。100マイクロリットルの活性化CD8細胞懸濁液をフィブロネクチンでコーティングされたプレートの各ウェルに加えます。次に、事前に調製したウイルス含有培地を1.5〜2ミリリットル加え、旋回運動で混合して細胞を均一に分注します。

プレートをジップロックバッグに密封し、2000 倍 g で摂氏 37 度で 90 分間遠心分離します。プレートを遠心分離機から取り外し、生物学的安全キャビネットに運びます。ビニール袋を慎重に取り出し、プレートの外側が培地で汚染されていないことを確認してください。プレートを摂氏37度の二酸化炭素インキュベーターに移します。

4時間後、各ウェルから1ミリリットルの培地を取り出します。1ミリリットルの予熱した完全T細胞培地と交換し、プレートをインキュベーターに戻します。