骨髄幹細胞からの原形質膜小胞の生成

0 views • 3:20 min • July 8th, 2025

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骨髄幹細胞培養から始めます。

トリプシン-EDTAバッファーを導入して細胞を分離し、細胞の塊を破壊して、単一細胞懸濁液を形成します。

心分離し、上清を除去します。ペレットを新鮮な培地で再懸濁します。

懸濁液をシリンジに移し、メンブレンフィルターユニットに接続します。

プランジャーを押して、濾液を含む媒体を廃棄します。

フィルターを取り外します。注射器に新鮮な培地を入れます。フィルターを再度接続し、プランジャーをすばやく押します。

液体の圧力により、セルはフィルターの細孔に向かって押し出されます。

これにより、球形の原形質膜小胞またはPMVが生成されます。

これらの小胞には、膜に囲まれた細胞成分と細胞小器官が含まれています。

立位相差顕微鏡で濾液を調べて、半透明の球状小胞を観察します。

小胞の寸法はフィルター膜の細孔サイズと一致し、PMVの生成を確認します。

PMVを生成するには、まず、摂氏37度、二酸化炭素5%の加湿インキュベーター内の6ウェルプレートの1つのウェルで完全なDMEM培養培地でマウスPMSCを培養します。細胞が90%のコンフルエントに達したら、0.5ミリリットルのカルシウムフリーPBSでウェルをすすぎ、0.5ミリリットルの0.25%トリプシン-EDTAで細胞を分離します。

摂氏37度で3分後、手のひらでプレートを数回軽くたたいて細胞解離を促進し、1ミリリットルの培地で消化を停止します。細胞を遠心分離のために5ミリリットルの円錐形チューブに移し、ペレットを4ミリリットルの新鮮な培地に再懸濁します。次に、新しい6ウェルプレートの2つのウェル間で細胞を分割し、プレートを細胞培養インキュベーターに24時間戻します。

翌日、先ほど示したように、トリプシン消化によって1つのウェルから細胞を回収し、遠心分離による収集後、ペレットを0.5ミリリットルの新鮮な培地に再懸濁します。細胞を1ミリリットルのインスリン注射器にロードし、シリンジをフィルターユニットに取り付けます。プランジャーをすばやく押し下げて、セルをフィルターに押し込み、押し出された培地を廃棄します。次に、先ほど示したように、0.5ミリリットルの余分な培地をフィルターにロードして分注し、2回目の押し出しから培地を回収します。

収集した培地150マイクロリットルを35ミリリットルのガラス底皿に播種し、小胞を約10分間沈殿させます。次に、CCDカメラを搭載した倒立位相差顕微鏡で、20倍対物レンズを使用してPMVの存在を確認します。

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Last updated: 18 July 2026