形質転換酵母細胞のマウス腸管免疫系への経口送達

ウラシルヌクレオベースを産生できない遺伝子組み換えされた栄養要求性酵母の懸濁液を含む経口チューブから始めます。

拘束されたマウスの口に口腔チューブを挿入し、胃まで導きます。

酵母懸濁液を胃に直接投与し、最終的に小腸に到達できるようにします。

小腸には上皮細胞が含まれており、その下には免疫細胞が豊富なパイエル板があります。

パイエル板の近くにある特殊な腸上皮細胞であるマイクロフォールド細胞は、酵母細胞を飲み込み、小胞に内在化します。

これらの小胞は細胞内を移動し、酵母細胞を下にあるパイエル板に放出します。

犠

牲したマウス腸からパイエルパッチを単離し、均一な細胞懸濁液を得る。

この細胞懸濁液をウラシルを含む酵母選択培地で培養します。

栄養要求性酵母はウラシルを利用して増殖してコロニーを形成し、形質転換された酵母細胞がマウスの腸免疫系に送達されることを確認します。

テキストプロトコルに従って酵母培養を調製した後、血球計算盤を使用して細胞濃度を測定し、1ミリリットルあたり10〜9番目の細胞に調整します。細胞を2,500倍gで3分間遠心分離してペレット化します。次に、上清を注ぎ、適切な量の滅菌水を加え、上下に穏やかにピペッティングして細胞を再懸濁します。

適切なゲージの強制経口針を1ミリリットルの滅菌注射器に固定し、酵母サンプルをロードして気泡を取り除きます。追加の注射器に滅菌水を装填して、対照マウスを強制経口します。利き手ではない手を使って、ガヴァージするマウスを手に取り、人差し指と親指で首の周りの皮膚をしっかりとつかみます。尻尾を小指の下に押し込みます。グリップがしっかりと固定されており、マウスが頭を動かさないようにしてください。

次に、中央の少し左に保ちながら、口蓋と喉の奥に沿って針を傾けて、強制経口針をマウス食道にそっと挿入します。マウスが針の球根を飲み込むのを待ちます。抵抗が感じられたり、マウスがあえぎ声を上げたりした場合は、そっと針を抜き、食道を探してみてください。

マウスが強制投与された針の球根を飲み込んだ後、シリンジプランジャーをそっと押し下げて、酵母をマウスの胃に直接投与します。マウスの胃と食道から強制経口針をそっと取り除き、マウスをケージに戻します。マウスが正常に呼吸し、動いていることを確認して、強制経口が適切に実行されたことを確認します。

テキストプロトコルに従ってマウスを犠牲にした後、腹部を完全に露出させた状態でマウスを配置し、70%エタノールを使用して腹部にスプレーします。はさみで、毛皮と皮膚を横方向に切開します。次に、切開部を手動でこじ開けて、腹部臓器を覆う薄い漿膜の内層である腹膜をさらに露出させます。腹膜をそっと持ち上げ、横方向に切開して腸を露出させます。

次に、鈍い鉗子を使用して、小腸を腸間膜動脈、脂肪、その他の組織から慎重にからかいます。マウス腹部の左上象限の胃から盲腸、大腸の始まりにある腸組織の大きなポケットに小腸を露出させます。

次に、小腸に沿って不透明な組織の1〜2ミリメートルのほぼ円形のパッチを探してパイエル斑を分離します。次に、湾曲した解剖はさみを使用して、パイエルパッチのドームを切り取り、周囲の組織が収集されないように余白を残します。

解剖したパイエル板を完全なIMDMに転送します。次に、パイエルパッチを懸濁した溶液を40マイクロメートルのセルストレーナーに注ぎます。パイエル板を完全なIMDMで洗浄した後、1ミリリットルの注射器のプランジャーを使用して組織を穏やかに分解し、細胞を50ミリリットルのチューブに集めます。ひずみ細胞を1,800 RPMで7分間ペレット化します。次に、待って、テキストプロトコルに従ってセルを分析します。