抗血管新生性腫瘍関連好中球の作製

腫瘍関連好中球(TAN)を含むマウス黒色腫腫瘍を取ります。

TAN は、酵素ニコチンアミド ホスホリボシルトランスフェラーゼ (NAMPT) の活性の上昇を示し、血管新生、腫瘍内の血管の増殖を刺激し、腫瘍の増殖を促進します。

組織をみじん切りにし、酵素を加えて組織マトリックスを分解し、細胞を緩めます。

懸

濁液をストレーナーと遠心分離機でろ過し、細胞をペレット化します。

溶解バッファーを加えて赤血球を溶解し、細胞破片を含む上清を遠心分離して廃棄します。

抗体を導入して細胞性Fc受容体を遮断し、それによって非特異的免疫染色を回避します。

TANの表面マーカーに特異的な蛍光色素標識抗体カクテルと、死んだ細胞を識別するための色素を導入します。

FACSを使用して、蛍光色素標識された生存可能なTANを単離し、マイクロプレートに移します。

選択したウェルに阻害剤を遮断するNAMPT活性を追加し、インキュベートします。

細胞を使用して、血管新生刺激能力を評価します。阻害剤で処理された TAN は、未処理の TAN と比較して血管新生の低下を示します。

腫瘍関連好中球の単離では、収穫時にウェルごとに5つの腫瘍を滅菌6ウェルプレートの個々のウェルに入れ、滅菌ハサミを使用して腫瘍を2〜3ミリメートルの断片に細かく刻みます。次に、1ミリリットルのディスクベースのコラゲナーゼ、DNase I溶液で腫瘍断片を摂氏37度、湿度5%の二酸化炭素で45分間消化し、15分ごとに10ミリリットルの注射器でサンプルを混合します。

インキュベーションの最後に、100マイクロメートルのストレーナーを介して細胞をウェルごとに1つの15ミリリットルのチューブにろ過して未消化の繊維を除去し、PBSを最終容量の15ミリリットルまで添加します。遠心分離によって解離した細胞を収集し、チューブあたり1ミリリットルの溶解バッファーで赤血球を溶解します。

混合後、各チューブの内容物を1つの15ミリリットルチューブに混ぜ合わせ、11ミリリットルの摂氏4度の完全な培地で2分後に反応を停止します。遠心分離後、ペレットを1ミリリットルのPBBSに再懸濁し、3マイクロリットルのFCブロック抗体で非特異的結合を氷上で15分間ブロックします。

インキュベーションの最後に、抗CD11bおよびLy6G抗体、およびその他の目的の抗体とDAPIで細胞を標識し、光から保護された氷上で30分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、細胞を14ミリリットルのPBSで洗浄し、ペレットを1ミリリットルあたり1 x 10⁷細胞の新鮮な完全培地濃度で氷上に再懸濁します。

次に、標準的な選別プロトコルに従って、蛍光活性化細胞ソーターでCD11b陽性のLy6G高DAPI陰性好中球を選別し、選別の最後にフローサイトメーターで単離された好中球の純度をチェックします。in vitro腫瘍関連好中球阻害の場合は、1.5倍10〜5番目に選別された好中球を96ウェルUボトムプレートの2つのウェルのそれぞれに播種し、FK866を完全培地中の最終濃度100ナノモルの1つのウェルに添加し、同量の完全培地のみをもう1つのウェルに添加します。細胞培養インキュベーターで2時間後、細胞をPBSで2回洗浄し、ペレットを適切な濃度でPBSに再懸濁して次の注射を行います。