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細菌の凝集を防ぐために、非イオン性界面活性剤で処理されたウシ菌BCGの懸濁液から始めます。
次に、ビオチン化試薬を加えてインキュベートします。
このビオチン化試薬は、機能性リンカーに複合体を形成したビオチンの複合体であり、ビオチン分子を細菌表面タンパク質に結合させ、細菌を標識します。
インキュベーション後、ビオチン標識細菌懸濁液を遠心分離して、未反応のビオチン化試薬を除去します。
細菌を緩衝液に再懸濁します。アビジン融合タンパク質、モノマーアビジンに融合した標的抗原ドメインを含む組換えタンパク質の溶液を追加します。
インキュベーション中、アビジンはビオチンに結合し、標的抗原による細菌の表面修飾を促進します。
懸濁液を遠心分離して、結合していない融合タンパク質を除去します。
抗原でコーティングされた細菌を、非イオン性界面活性剤を含む緩衝液に再懸濁します。細菌の抗原コーティングは、その特性を強化して免疫応答を引き起こす可能性があります。
BCGはレベルIIの病原体であるため、個人用保護具を使用してバイオセーフティキャビネットで作業してください。
BCG細胞の表面をビオチン化するには、まずシェーカープラットフォーム上で細胞を適切な密度まで増殖させます。約10億個の細胞を収集し、500マイクロリットルの氷冷エンドトキシンフリーPBSTを使用して3回洗浄します。次に、細胞をスピンダウンし、無菌エンドトキシンフリーPBSに懸濁します。次に、滅菌ろ過水中で新鮮な10ミリモルのSulfo-NHS SSビオチンを調製します。次に、0.5ミリモルのSulfo-NHS SSビオチンを含む1ミリリットルのブロスで細菌をインキュベートします。室温で30分間インキュベーションを行います。
次に、標識された細菌を500マイクロリットルの氷冷PBSTで3回洗浄し、未反応の試薬を除去します。次に、ペレットを1ミリリットルのPBSTに再懸濁します。
5億個のビオチン化BCGをアビジン融合タンパク質と混合し、最終濃度を1ミリリットルあたり10マイクログラムのタンパク質にします。この反応を室温でシェーカーで1時間放置します。次に、500マイクロリットルの氷冷PBSTで細菌を3回洗浄します。