樹状細胞の高塩分処理法とマウスへの養子移植

樹

状細胞またはDCの懸濁液を含むマルチウェルプレートから始めます。

高血圧状態を模倣するには、高濃度のナトリウムイオンを含む培地を加えてインキュベートします。

インキュベーション中、ナトリウムイオンが細胞に入り、細胞内ナトリウム濃度が上昇します。

これにより、細胞内ナトリウムイオンと細胞外カルシウムイオンの交換が引き起こされます。

内部カルシウムレベルの増加は、細胞タンパク質に結合する反応性アルデヒドの生成を促進する経路を活性化します。これによりDCが活性化され、これらの修飾されたタンパク質が表面に表示されます。

インキュベーション後、細胞をチューブに集めて遠心分離します。

上清を取り除きます。新しいバッファーを加えて細胞を再懸濁します。

細胞懸濁液を注射器に引き込みます。

麻酔をかけたマウスを取り、眼窩の後ろの領域である眼窩後部に細胞懸濁液を注入します。

活性化された免疫細胞を注入するこのプロセスは、養子細胞移植と呼ばれます。

900マイクロリットルのDC懸濁液を24ウェルの平底の平底ファルコンプレートにピペットで入れます。100マイクロリットルの高塩DC培地を各ウェルに加え、最終的なナトリウム濃度を190ミリモルにします。プレートにラベルを付け、摂氏37度の加湿した二酸化炭素インキュベーターに48時間置きます。

48時間後、インキュベーターからプレートを取り出します。細胞培養培地を1つのウェルで上下に一掃して、CD11c陽性DCを再懸濁します。すべての懸濁液を対応する標識付き1.6ミリリットルチューブに移します。プレーティングされた個々のウェルごとにこれを繰り返します。

すべてのチューブを300倍g、摂氏4度で10分間遠心分離します。上清を吸引し、DCペレットを100マイクロリットルの滅菌DPBSで再懸濁します。次に、チューブの 1 つから DC 溶液を 27 ゲージのハーフインチ針を備えた 1 ミリリットルの注射器に引き込みます。

ナイーブな雄、生後10週間、C57ブラック6マウスを2%イソフルランの下に置き、安定した手術面を実現します。ペダル反射の欠如で麻酔のレベルを確認します。安定した手術面が得られたら、針を約 30 度の角度でゆっくりと慎重に眼窩後空間に導入します。

ゆっくりとスムーズに、CD11c陽性DC懸濁液を注入します。注射が完了したら、眼を傷つけないように注意しながら、眼窩後腔の針を慎重に取り外します。次に、マウスをノーズコーンから取り出し、麻酔からの回復中に約30分間監視します。