人工多能性幹細胞からの単一陽性CD8 T細胞の生成

培養誘導多能性幹細胞をゼラチンマトリックス上の間質細胞のフィーダー層上

フィーダー層は自然の細胞外環境を模倣し、幹細胞を造血前駆細胞を含むドーム型のオルガノイドに分化させます。

酵素を加えて共培養細胞を解離させます。

間質細胞の接着のために、細胞を新鮮なゼラチンでコーティングされた皿に移します。

接着していない造血前駆細胞を分化培地に集めます。

新鮮なフィーダー層で培養して、前駆細胞のCD4およびCD8受容体を持つ二重陽性T細胞と、両方の受容体を欠く二重陰性T細胞への分化を促進します。

細胞をチューブに移します。二重陽性T細胞に選択的にタグを付けるCD4特異的抗体を運ぶ磁気ビーズでインキュベートします。

磁気分離器を使用して二重陽性細胞を分離し、新鮮なフィーダー層で培養します。

サイトカインと抗体の混合物を補給して細胞を刺激し、CD4受容体のダウンレギュレーションを誘導し、CD8単一陽性細胞への分化を促進します。

糊化したOP9-デルタ-1皿をヒトIPSCと共培養する1週間前に調製します。4ミリリットルの0.1%ゼラチンを3つの新しい細胞培養皿に加え、摂氏37度で30分間インキュベートします。インキュベーション後、ゼラチンを吸引し、各皿に8ミリリットルのOP9培地を加えます。OP9-デルタ-1細胞のコンフルエントディッシュ1個をゼラチンでコーティングされた3つのディッシュに継代します。

4日後、細胞の各ディッシュに10ミリリットルのOP9培地を加え、ディッシュあたり合計20ミリリットルの培地を加えます。細胞を継代してから7〜8日後に、OP9-デルタ-1コンフルエンス皿でヒトIPSC共培養を開始します。ヒトIPSCのコンフルエントディッシュから培地を吸引し、10ミリリットルのOP9培地を加えます。

使い捨ての細胞継代ツールを使用して細胞コロニーを切断および分離し、350〜600塊の切断コロニーを10ミリリットルの新鮮なOP9培地を含むプレゼラチン化OP9-デルタ-1皿に移します。培養皿を左右、前後に揺らして、コロニーの均一な分布を確保します。翌日、使用済み培地を吸引し、20ミリリットルの新鮮なOP9培地と交換します。

OP9-デルタ-1で1日共培養されたヒトIPSC塊は、小さくて丸い単層コロニーとして現れるはずです。5日目に、使用済み培地10ミリリットルを吸引し、新鮮なOP9培地10ミリリットルを加えます。コロニーは、多層の暗い中心を特徴とする原始的な中胚葉に分化し始めます。

9日目にこのプロセスを繰り返すと、多層の中心構造がドーム状に進化します。13日目に造血前駆細胞を採取し、その時点で構造はドーム状の領域のネットワークに囲まれた暗い中央オルガノイドで構成されています。培地を吸引し、カルシウムとマグネシウムを含む1xフェノールレッドフリーハンクバランス塩溶液またはHBSSで5ミリリットルで細胞を1回洗浄します。

洗浄後、250マイクロリットルの5,000単位の5,000単位のコラゲナーゼ-4を10ミリリットルのHBSSに加えます。混合物を細胞に加え、摂氏37度で45分間インキュベートします。HBSS-コラゲナーゼ混合物を吸引し、5ミリリットルのPBSで細胞を1回洗浄します。PBSで洗浄した後、5ミリリットルの0.25%トリプシン-EDTAを加え、細胞を摂氏37度で20分間インキュベートします。

次に、4ミリリットルのOP9培地を加え、ピペッティングによって細胞層を結合させ、単一細胞懸濁液を作ります。細胞懸濁液を100マイクロメートルのストレーナーを介して50ミリリットルの円錐形チューブに移し、チューブを300倍gおよび摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を吸引し、細胞を10ミリリットルのOP9培地に再懸濁します。

細胞懸濁液を新しい糊化した10センチメートルの細胞培養皿にプレートし、摂氏37度で45分間インキュベートします。次に、穏やかなピペッティングによって非接着細胞を収集します。細胞懸濁液をストレーナーを介して50ミリリットルの円錐形チューブに移し、前述のように遠心分離します。次に、上清を吸引し、細胞を10ミリリットルの分化培地に再懸濁します。

細胞懸濁液を新しいOP9-デルタ-1コンフルエントディッシュにプレートします。原稿の指示に従って16日目に細胞を継代し、その後5〜7日ごとに非接着細胞を継代し続けます。35日間の分化後、メーカーのプロトコルに従ってCD4磁気ビーズ単離によってCD4陽性細胞集団を濃縮します。

次に、細胞をOP9培地に再懸濁し、1ミリリットルの細胞懸濁液をコンフルエントOP9-デルタ-1の組織培養平底24ウェルプレートの各ウェルにプレートします。各ウェルに100国際単位のヒトIL-2、5ナノグラムのヒトIL-7、500ナノグラムの抗ヒトCD3抗体、および2マイクログラムの抗ヒトCD28抗体を添加して細胞を刺激します。4〜7日後、細胞を採取してさらに分析することができます。