凍結胚性ニューロンからの低密度初代ニューロン培養物の生成

凍結保存された胚ニューロンを含むクライオバイアルから始めて、制御された解凍のために加熱ブロックに入れます。

次に、解凍したニューロンをチューブに移し、神経基底培地で滴下希釈して浸透圧のバランスをとり、細胞溶解を防ぎます。

これにより、ニューロンが均一に分散した均質な懸濁液が生成されます。

釈した神経懸濁液を、栄養素と抗生物質が豊富な神経基底培地を含むポリ-L-リジンでコーティングされたマルチウェルプレートに播種します。

キュベートして、正に帯電したポリ-L-リジンが静電相互作用を介してニューロンと相互作用し、それらの付着を促進します。

ウェルに新鮮な神経基底培地を供給します。

培地の蒸発を防ぐために、湿気の多い条件下で細胞を同じ培地でインキュベートします。

胚性ニューロンは栄養素を利用し、ニューロンのプロセスを発達させ、一次ニューロンを形成することによって成長します。

神経基底培地は、間隔が広い初代ニューロンを維持し、ニューロン接続を持つ低密度初代培養物を生成します。

、96ウェルのマイクロプレートをウェルあたり100マイクロリットルのポリ-L-リジンでコーティングします。次に、プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。インキュベーションの最後に、ポリ-L-リジン溶液を除去します。プレートを滅菌水で2回、サプリメントを含まない新鮮な培地で1回洗浄します。プレートを外に出して乾かします。ドライプレートは、摂氏4度で最大1か月間包んで保存できます。

細胞播種を開始するには、コーティングされたプレートの各ウェルに50マイクロリットルの培地を追加します。周辺ウェルに200マイクロリットルの滅菌水を入れ、プレートを摂氏37度で5%の二酸化炭素で1時間インキュベートします。

液体窒素タンクからニューロンクライオバイアルを取り出し、摂氏37度のヒートブロックに入れて内容物を部分的に解凍します。ワイドボアチップを備えた1ミリリットルピペットを使用して、バイアルの内容物を滅菌済みの50ミリリットルチューブにゆっくりと滴下します。空のクライオバイアルを1ミリリットルの室温培地ですすいでください。すすぎ液を細胞懸濁液を含む50ミリリットルのチューブに移します。

次に、9ミリリットルの室温培地を50ミリリットルのチューブに滴下し、11ミリリットルの容量にします。血球計算盤を使用して細胞をカウントした後、細胞懸濁液をリザーバーに移します。次に、ワイドボアチップを備えたマルチチャンネルピペットを使用して、ウェルあたり1.0 x 10⁴細胞の最終カウントで細胞懸濁液をコーティングされた96ウェルプレートに分注します。

ニューロンを摂氏37度で5%の二酸化炭素の下で1〜2時間インキュベートします。次に、培地を100マイクロリットルの予熱培地と交換し、同じ条件で再度インキュベートします。