ラット小脳顆粒ニューロン培養物からのミクログリアの選択的除去

収穫したラット小脳を取り、断片に切り刻みます。

フラグメントをトリプシンの入ったチューブに移し、インキュベートします。

トリプシンは組織の細胞外マトリックスを消化し、小脳顆粒ニューロンだけでなく、ミクログリアや星状細胞などの非ニューロン細胞も緩めます。

トリプシン阻害剤とDNaseを含むバッファーを追加します。阻害剤はトリプシンを不活性化し、DNaseは汚染されたDNAを分解します。

遠心分離して上清を廃棄します。

を阻害剤とDNaseを含むバッファーに再懸濁し、機械的に解離して単一細胞懸濁液を形成します。

濁液をタンパク質含有緩衝液に重ねます。

細胞破片を含む上清を遠心分離して廃棄します。

細胞を培地に再懸濁し、ポリ-L-リジンでコーティングされたカバーガラスに播種して、細胞の付着を促進します。

メディアを取り出します。細胞を新鮮な培地で洗浄し、グリア細胞の増殖を防ぐために細胞周期阻害剤を含む培地を追加します。

培地の半分をリソソーム阻害剤を含む新しい培地に交換します。

阻害剤はミクログリアを選択的に標的とし、リソソーム膜を破壊し、ミクログリアの死と培養からの除去を引き起こします。

この手順は、生後4〜7日のラットの子犬から小脳を収集することから始めます。氷上の溶液A5ミリリットルを含むシャーレにすぐに入れます。次に、小脳から余分な溶液を取り除き、組織をペトリ皿の蓋に入れます。次に、よく燃えたカミソリの刃でティッシュを少なくとも3つの異なる方向に細かく刻

いて、みじん切りにしたティッシュを溶液Bに加え、摂氏37度の水浴に5分間入れ、数分ごとに穏やかに振る。次に、20ミリリットルの溶液Dをチューブに加えてトリプシンを中和します。振とうして65gで5分間遠心分離します。その後、上清を注ぎます。4ミリリットルの溶液Cに再懸濁します。

濁液が可能な限り均一になるまで、直径を小さくする3つの火炎ガラスピペットのそれぞれでサンプルを10回粉砕します。次に、BSA-EBSSの上にこのホモジネートを数滴ゆっくりと穏やかに加えます。BSA-EBSSを通り抜け始めたら、さらに粉砕し、溶液Cをもう少し加えます。ホモジネートは、BSA-EBSSの上の層に配置される必要があります。

100gで5分間回転させ、振らないでください。次に、上清を取り除き、ペレットを1ミリリットルのMEM培地に再懸濁します。血球計算器を使用して細胞をカウントし、500マイクロリットルのMEM培地でカバーガラスあたり800,000細胞でプレートします。その後、それらを摂氏37度のインキュベーターに入れ、6%の二酸化炭素を入れます。次に、細胞周期阻害剤であるAraCを10マイクロモル含むMEM培地の溶液を作ります。

各カバーガラスについて、250マイクロリットルの古い培地を新鮮な24ウェルプレートに保持し、残りを吸引します。250マイクロリットルの通常のMEM培地を加えて細胞を洗浄します。続いて、250マイクロリットルの古い培地を細胞に戻し、250マイクロリットルのAraC含有培地を補充します。

この手順では、純粋なLMEを5ミリリットルのMEM培地に加えて、最終濃度150ミリモルのLMEを与えます。酸塩基溶液を使用して溶液をpH 7.4に戻します。次に、0.2マイクロメートルのシリンジフィルターを備えた28ミリメートルのPESを使用して滅菌ろ過します。

次に、LME溶液をMEM媒体中で50ミリモルの濃度に希釈します。次に、対照培養用の通常のMEM培地と一緒に摂氏37度のウォーターバスに10分間置きます。10分後、各CGC培養物から250マイクロリットルのMEM培地を除去します。次に、メディアを摂氏37度に保持します。

次に、2倍のLMEを含むMEM培地、または対照培養用のLMEを含まない予熱されたMEM培地で細胞を処理します。細胞を摂氏37度で、6%の二酸化炭素を含む加湿雰囲気で1時間インキュベートします。その後、新鮮な予熱したMEM培地で細胞を2回洗浄して、LME含有培地を除去します。

次に、保持した培地を同量の新鮮な予熱MEM培地と交換します。最後に、培養物を摂氏37度の6%加湿二酸化炭素でインキュベートします。