のDNAフィンガープリント結核菌株 - 断片長解析（FLA）

本手順の全体的な目的は、ハンセン病の原因となる非培養性細菌であるmycobacterium lepraeの、臨床検体から直接得られる識別用DNAフィンガープリントを構築することです。患者の生検組織から抽出したM. lepraeの細菌DNAを、可変数タンデムリピート（VNTR）遺伝子座に特異的な蛍光プライマーを用いたマルチプレックスPCRによって増幅します。DNAの増幅後、キャピラリー電気泳動を行い、フラグメント長解析を実施します。

各遺伝子座におけるショートタンデムリピートDNAセグメントの数を決定するために、データを解析します。EPRIの異なる株は、各遺伝子座で異なる数のタンデムリピートを示すためです。複数の遺伝子座からのデータによって固有のDNAフィンガープリントが得られ、この手法を用いることで患者の株型のデータベースを作成することが可能です。

特定のコミュニティ内および世界規模でのハンセン病患者間における集団構造、進化、および伝播を特徴づけることは、最終的にハンセン病根絶のための遺伝学的ツールと根拠を提供することにつながります。この手法は、ハンセン病の拡大の追跡、最近の感染クラスターやリスクの高い個人の特定、および管理プログラムの有効性の測定に使用できます。本手順のデモンストレーションは、私の研究室の研究者であるLeeとRon Jensen、および機器コア施設（instrument core facility）のJason Riversが行います。標準的なKaiGen DNA抽出キットを用いて、臨床生検検体からDNAを抽出します。

DNAを取得した後、清潔なPCRキャビネット内に新しい作業エリアを設けます。DNAコンタミネーションを防ぐため、キャビネットとピペットセットを70% ethanolで拭き上げ、キャビネットとピペットに15分間UV光を照射します。キャビネットが清潔になったら、マルチプレックスPCRの準備を行います。各マルチプレックスPCRには4〜5組のプライマーペアを用い、ペアごとに1本のプライマーに蛍光ラベルを付加します。

混合する必要があります。TEバッファーで調製した10 µMのプライマーストックを用いて、プライマーミックスを作成します。フォワードプライマーまたはアッパープライマーをすべて等量、単一のチューブに混合し、最終濃度が2 µMになるようにします。必要に応じて、各プライマーにTEバッファーを加えて調整してください。

別のエッペンドルフチューブで、同様の方法ですべてのリバースプライマー（または下流プライマー）を混合します。プライマーミックスが完成したら、PCR MSEミックスを調製します。サンプルごとのすべての検体およびコントロールを記載したプレートマップを作成してください。

マスターミックスには、KaiGen multiplex PCR mixを12 µL、各プライマープールを2 µL、およびQ solutionを2 µL含める必要があります。コントロール分を含め、ピペッティングによる損失を考慮して十分な量のマスターミックスを調製してください。マスターミックスを軽く遠心分離します。

次に、マスターミックスを18 µLずつPCRプレートの各ウェルに分注します。DNAサンプルのコンタミネーションを防ぐため、手袋を交換し、別のバイオセーフティキャビネットを拭き上げて消毒してください。前述と同様に、フードの除染が完了したら、プレートをそのフード内に移動させます。

次に、マスターミックスが入った各ウェルに2 µLのDNAサンプルを加えます。相互汚染を防ぐため、必ずエアロゾル防止ピペットチップを使用してください。PCRプレートを慎重に密閉し、短時間遠心して内容物を混合します。

次に、反応プレートをサーモサイクラーにセットし、提出サンプルのPCRプログラムを開始します。フラグメント解析（FLA）では、ホルムアミドサイズ、マスターミックスを準備し、清潔なエッペンドルフチューブに希釈したPCR産物を加え、テストするサンプル1検体あたり12 µLの高純度ホルムアミド溶液と0.3 µLのGeneScan 500 LIDサイズ標準を混合します。この溶液12.3 µLを、96ウェル光学品質反応プレートの各ウェルに分注します。

PCR完了後、プレートを遠心分離します。各サンプルの位置がプレートマップに記録されていることを確認してください。次に、別の96ウェルプレートに、1ウェルあたり59 µLのヌクレアーゼフリー水を分注し、そこに各PCR反応液を1 µLずつ加えて、増幅されたDNAを1:60に希釈します。

DNAの希釈が完了したら、マルチチャンネルピペットを使用して、希釈した各PCRサンプル1 µLを、ホルムアミド溶液が入ったプレートの対応するウェルに分注します。プログラムが完了した後、標準的なアガロースゲル電気泳動によりサンプルをテストし、予測サイズのDNA断片が増幅されていることを確認できます。サンプルをFLAジェネティックアナライザーによる蛍光キャピラリー電気泳動での分析に備え、分析前にプレートにセプタムを取り付け、短時間遠心して気泡を除去し、サンプルをウェルの底に落とします。

IDEによりストランドが化学的に変性するため、加熱変性の必要はありません。プレートをローディングトレイにセットします。ABBI'S genetic analyzer 31 30 xlなどのキャピラリー電気泳動を用いて、ラベル付けされたPCR産物を評価します。

分離媒体としてPOP-7ポリマーを満たした50 centimeterのキャピラリーを用いてサンプルを分析します。DNAはキャピラリーの末端に向かって移動し、そこでレーザーと検出器が蛍光ラベルを測定します。アナライザーの収集ソフトウェアを起動してください。サンプルの分析前に、サイズスタンダードを含む、使用するすべての色素を検出できるようにアナライザーを校正する必要があります。これらのサンプルに使用するdsetはABIのG5です。サンプルは1.6 kilovoltsで15秒間、電気泳動的に注入されます。

15 kilovoltsを1800秒間印加してフラグメントを分離します。1ランあたりの総所要時間は約45分です。ランが完了したら、各サンプルのデータファイルを作成します。

解析装置の収集ソフトウェアにより、ファイルはあらかじめ指定された場所のプレートフォルダに保存されます。ファイル形式はFSA形式です。FLAデータは、Applied Biosystemsのウェブサイトで無料で提供されているピークスキャナーソフトウェアを使用して解析できます。

データを分析するには、[start new project]をクリックし、次に[add files]をクリックします。ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを含む、選択したデータファイルをプログラムに読み込みます。読み込まれたファイルを選択して分析します。

結果はFLAクロマトグラムとしてプロットされます。サイジングスタンダードはオレンジ色のピークとして表示され、色の付いたピークはサンプル中で解析された各ローカスの細菌DNA検体を表します。ピークをクリックすると、その塩基対サイズを確認できます。DNAポリメラーゼのスリップストランド合成により、一部のマイクロサテライトローカスでは、同じ色のピーク群が検出されます。

これらの場合、通常は振幅が最大であるピークを選択します。各サンプルの断片サイズを陽性対照のサイズと比較して、テストした各アレルにタンデムリピートセグメントがいくつ存在するかを判定し、さらなる解析のためにデータをExcelスプレッドシートに記録します。この図では、同じ村の3つの異なる家族に属する7人の患者からの分離株のDNAフィンガープリントが示されており、解析した各多型遺伝子座のタンデムリピート数が表示されています。

これらのデータは、家族Bの2人のメンバーが同一株に感染している一方で、もう1人のメンバーは異なる株に感染していることを示唆しています。家族Cのメンバーは、同一株に感染している可能性が高いと考えられます。家族Aのメンバーについても同様です。このビデオを視聴することで、クリニックに来院したハンセン病患者のV-N-T-R-D-N-Aフィンガープリントを取得するために、マルチプレックスPCRとフラグメント解析を日常的に組み込む方法について十分に理解できるはずです。

これらは、ハンセン病対策における従来の疫学を補完するための新しい分子ツールです。