Name: のDNAフィンガープリント結核菌株 - 断片長解析（FLA） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 学ぶ、臨床検体からMycobacterium lepraeのDNAフィンガープリントを作成する方法。多重PCRとVNTR解析により、ハンセン病の伝播追跡と感染クラスター特定が可能になり、公衆衛生介入に貢献します。

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資金は、NIH / NIAIDの助成金RO1 - AI - 63457およびARRA助成金補助RO1 - AI - 63457 S1によって提供されていました。我々は、実験グループと共同研究者のすべての現在および過去のメンバーの貢献を認める。

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ハンセン病の患者から皮膚サンプルの収集は、皮膚クリニックで働く熟練した臨床医や技術者が必要です。これらのサンプルを扱う研究室の労働者は、白衣、手袋、保護メガネを着用を着用し、人間やアルマジロ組織の感染サンプルを取り扱う際にはバイオセーフティキャビネット内で動作するように細心の注意を払う必要があります。面とツールの消毒も重要です。清潔、滅菌バイオセーフキャビネットでの作業は、DNAサンプルの汚染を回避するために重要です。 DNA抽出は、キアゲンのような企業から抽出キットの開発に比較的容易に感謝となっています。指示に注意深く従っている必要があります。使用しないときは全てのサンプルは低温に保たれるべきである。サンプルの繰り返し、極端な温度変化は避けてください。 本研究で使用したDNAプライマーは、本論文の末尾に参考文献のリストに引用されている様々な企業から注文することができます。ケアは、汚染を避けるために、DNAのない環境でプライマーを用いて動作するように注意が必要です。プライマーは、少量（ 図2a）に分け、乾燥粉末として来るとTEと混合し、100μMの濃度に希釈する必要があります。プライマーのワーキング溶液をさらに10μMの濃度に希釈されています。再び、プライマーが使用され、用意されている地域/フードでDNAサンプルを使用しないでください。 使用しないときは、PCR産物はまた寒さに保つ必要があります。 3％アガロースゲルの調製は、より良いDNAのバンドの分離を与えるが、実行に時間がかかりますでしょう。純粋に定性的な目的のために、2％は通常は十分です。アガロースゲルでDNAを染色するために使用される臭化エチジウム溶液は、皮膚から吸収されている非常にアクティブな遺伝毒性物質である。このソリューションは、それは細心の注意を使用して、常に手袋を着用しているで染色したゲルを取り扱う。任意のDNAサンプルやエチジウムブロマイドの材料を取扱い後はよく手を洗う。エチジウムブロマイド染色液を廃棄する際、制度的なガイドラインに従って洗浄し、ゲル。ゲルは日常的に必須ではありません。FLA方法が確立された後、このステップを排除することができます。それは時間と試薬のかかる作業です。 FLAのための試料の調製に用いホルムアミド溶液はまた、非常に毒性があり、取り扱いには注意してください。その使用後はよく手を洗う。制度的なガイドラインに従って、それを処分する。 ピークスキャナのソフトウェアを使用してFLAの結果を読み込むことは困難な場合があります。アレルコール（タンデムリピートの数）の基本セットは、CSU（ 表4-7）で開発されています。 （M.の他の株がらい研究を行っているとして、それは4月7日テーブルはすべての包括的ではないかもしれないことに留意すべきである。、記載されている範囲outsideのコピー数を持つ対立遺伝子が発見されることがあります。）一つの特定の課題は&quot;スタッター&#39;のピークを伴う。これらは、特に唯一、10（TA）として2〜3塩基対の繰り返しを、含むSTRをのピークの家族、です。時には読み取るための正しいピークを選択することは困難である（ 図7）。この図では、190 bpの陽性対照のピークが主ピークである。 2である高さの低いピークは、4、あるいは6塩基対は、大規模なまたは主ピークよりも小さい&quot;スタッターピーク&quot;と呼ばれているテーリングも混乱を引き起こす可能性があります。テーリングは、以前のテキストで、 図8に記載されています。最後に、PCR産物は、サンプル中の非常に豊富である場合、ピークはダブルスパイクで表示されることがあります。この場合、ピークフォームの中央を読んで。 （ 図6、患者6を参照してください。） データ管理は、この種の作業のための手ごわい作業になる場合があります。タスクまたはプロシージャの日付、演算子、ストリップ/プレートのマップ、FLAの受注、PCR条件とレシピ、ゲルや写真の日付、保存温度、DNAテンプレートの希釈、FLA：などのすべての実験のすべての関連情報を記録することが重要です。電子ファイルの保管場所、等グッド組織とデータの管理は、時間の時間を節約することができます将来、特定の情報の断片を探して過ごした。 ここで説明する実験室での作業は、コロラド州立大学で、世界中の他の場所で数年前から続いている。収集されたデータのすべてを意味し、どのように将来の使用の可能性があるものの拡大写真が現れ始めている。 図10Aおよび図10Bは、これらのDNAフィンガープリントが異なるM.を区別するために使用できる方法を示しています家族（10B）との間であっても国（10A）または間にらい菌。家族やコミュニティリンクされているケースはM.を運ぶことが示されているらい類似または同一のVNTRの歪みの種類の。希望は、それは、伝送ネットワークの早期発見のシステムがそれらの人々のMOSのために開発されるように、ハンセン病の伝送のモード（S）さらなる洞察を得ることが可能かもしれないということです永続的な神経学的および皮膚損傷が行われる前に、リスク、およびその治療薬物療法ではtが開始することがあります。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td> DNeasy血液と組織のキット</td><td>キアゲン</td><td> 69504 </td><td></td></tr><tr><td>マルチプレックスPCRキット</td><td>キアゲン</td><td> 206143 </td><td></td></tr><tr><td> DNAプライマー</td><td>様々な</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アガロースゲル</td><td>様々な</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5倍または6倍ゲルローディングバッファー</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td> B7021S </td><td>あなた自身の*を作るために利用できるレシピ</td></tr><tr><td>臭化エチジウム溶液</td><td>様々な</td><td></td><td> CONから希釈する。 </td></tr><tr><td>こんにちは - ジホルムアミド溶液</td><td>アプライドバイオシステムズ</td><td> 4311320 </td><td></td></tr><tr><td>ジーンスキャン-500リズ</td><td>アプライドバイオシステムズ</td><td> 4322682 </td><td></td></tr></tbody></table> <a href="http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html">* http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html</a> <table border="1"><tbody><tr><th>機器</th><th>コメント</th></tr><tr><td> 2冷蔵庫</td><td> 4 ° C：プライマーおよび多重化試薬のためのDNAサンプルの1、1 </td></tr><tr><td> 1電子レンジ</td><td>ゲルを作るためにアガロースと水を加熱するためのまたは適切な方法</td></tr><tr><td> 1オートクレーブ</td><td>材料を殺菌するためのまたは圧力鍋</td></tr><tr><td> PCRマシン</td><td>クラー</td></tr><tr><td>ピペットの2セット</td><td> 0.5から10μlを、10〜100μlを、20〜200μlを、プライマー1000μlの1セット、DNAの1セット</td></tr><tr><td>潜水艦ゲル電気泳動ボックス</td><td>準備ゲル用のフォームや櫛ている。 </td></tr><tr><td>電気泳動用電源</td><td>ゲルボックスへの接続用ケーブルを使用</td></tr><tr><td>ヒートブロック</td><td>エッペンドルフチュー​​ブ用</td></tr><tr><td>遠心</td><td>エッペンドルフチュー​​ブ/ストリップ用</td></tr><tr><td>キャピラリー電気泳動システム（遺伝アナライザ） </td><td>またはこの分析を実行できる機関へのアクセス</td></tr><tr><td>プラスチック</td><td>使い捨てエアロゾルピペットチップ、エッペンドルフチュー​​ブ、8ウェルストリップ、96ウェルプレート、光学的品質のいくつか</td></tr><tr><td>インターネットに接続されたコンピュータ</td><td></td></tr></tbody></table>

のdnaフィンガープリント<emらい>結核</em可変数のタンデムリピート（vntr）を使用>菌株 - 断片長解析（fla）

DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA)

ハンセン病の伝送の研究は、病原以来、 結核菌はらい 、実験室で培養することができない特に困難です。細菌の唯一の源は、ハンセン病の患者、および実験的に感染アルマジロやヌードマウスです。従って、現代の疫学で使用されているメソッドの多くは、ハンセン病の研究のため使用できません。 WHO 1で実装されたハンセン病のための広範なグローバルな薬物治療プログラムにもかかわらず、ハンセン病は約25万の新たな症例は毎年多くの国では風土病のまま2全体M.らい菌ゲノムは、3,4をマッピングされており、多くの遺伝子座は、（マイクロおよびminisatellitesと呼ばれる）2つ以上の塩基対のセグメントを繰り返していることが確認されている。M. 5臨床菌株は、 らいこれらの遺伝子座の多くでタンデム繰り返しセグメント（ショートタンデムリピート、STR）の数が異なる場合があります。5,6,7可変数のタンデムリピート（VNTR）5分析は、ハンセン病菌の異なる菌株を区別するために使用されています。遺伝子座のいくつかは他の人が同じ患者でもある、より急速に変化するように見える一方、繰り返し数であまり変化を示す、他のものより安定しているようです。特定のVNTRsの変動は歪タイピング7,8,9のための適性に関する質問を育てているが、新興のデータは、その安定性で多様化している複数の遺伝子座を、分析し、貴重な疫学的ツールとして使用できることを示唆している。複数の遺伝子座VNTR分析（MLVA）10が中国11,12、マラウイ8、フィリピン10,13、およびブラジル14を含むいくつかの国でハンセン病の進化と伝達を研究するために使用されています。 MLVAは、複数の手順が含まれます。最初に、細菌のDNAは、臨床生検またはスリットの皮膚スメア（SSS）から宿主組織のDNAと一緒に抽出されます。10は 、目的の遺伝子座は、その後、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を経由して抽出したDNAから増幅されています。 4月5日別の遺伝子座のための蛍光標識プライマーを10 PCR産物が所望のDNAセグメントの存在を確認するためにアガロースゲル電気泳動に供されることがあります。18遺伝子座は4つの反応の合計で増幅されていると、反応ごとに使用、とされていますキャピラリー電気泳動を用いた蛍光断片長解析（FLA）のために提出。各遺伝子座の繰り返しコピーの数がわかっているアルマジロ継代細菌からのDNAをポジティブコントロールとして使用されます。 FLAのクロマトグラムは、 ピークスキャナのソフトウェアと断片の長さを用いて検討しているVNTRのコピー数（対立遺伝子）に変換されます。最後に、VNTRのハプロタイプは、パターンが分析され、そして患者の臨床データと組み合わせることで、歪みの種類の分布を追跡するために使用することができます。

によって引き起こされるハンセン病、<emらい&gt;結核</em&gt;、多くの場所ではまだ流行している。ハンセン病の伝送の普及とモードについて学ぶために、それはどの菌株のかを決定することが重要です。<em&gt; M.らい</em&gt;は、患者を感染している。縦列反復の変数番号（VNTR）タイピングは、そのようなメソッドです。

のDNAフィンガープリント<emらい>結核</em可変数のタンデムリピート（VNTR）を使用>菌株 - 断片長解析（FLA）

ハンセン病の伝播に関する研究は、原因菌であるMycobacterium lepraeを実験室で培養することができないため、特に困難である。

本手順の全体的な目的は、ハンセン病の原因となる非培養性細菌であるmycobacterium lepraeの、臨床検体から直接得られる識別用DNAフィンガープリントを構築することです。患者の生検組織から抽出したM. lepraeの細菌DNAを、可変数タンデムリピート（VNTR）遺伝子座に特異的な蛍光プライマーを用いたマルチプレックスPCRによって増幅します。DNAの増幅後、キャピラリー電気泳動を行い、フラグメント長解析を実施します。各遺伝子座におけるショートタンデムリピートDNAセグメントの数を決定するために、データを解析します。EPRIの異なる株は、各遺伝子座で異なる数のタンデムリピートを示すためです。複数の遺伝子座からのデータによって固有のDNAフィンガープリントが得られ、この手法を用いることで患者の株型のデータベースを作成することが可能です。特定のコミュニティ内および世界規模でのハンセン病患者間における集団構造、進化、および伝播を特徴づけることは、最終的にハンセン病根絶のための遺伝学的ツールと根拠を提供することにつながります。この手法は、ハンセン病の拡大の追跡、最近の感染クラスターやリスクの高い個人の特定、および管理プログラムの有効性の測定に使用できます。本手順のデモンストレーションは、私の研究室の研究者であるLeeとRon Jensen、および機器コア施設（instrument core facility）のJason Riversが行います。標準的なKaiGen DNA抽出キットを用いて、臨床生検検体からDNAを抽出します。DNAを取得した後、清潔なPCRキャビネット内に新しい作業エリアを設けます。DNAコンタミネーションを防ぐため、キャビネットとピペットセットを70% ethanolで拭き上げ、キャビネットとピペットに15分間UV光を照射します。キャビネットが清潔になったら、マルチプレックスPCRの準備を行います。各マルチプレックスPCRには4〜5組のプライマーペアを用い、ペアごとに1本のプライマーに蛍光ラベルを付加します。混合する必要があります。TEバッファーで調製した10 µMのプライマーストックを用いて、プライマーミックスを作成します。フォワードプライマーまたはアッパープライマーをすべて等量、単一のチューブに混合し、最終濃度が2 µMになるようにします。必要に応じて、各プライマーにTEバッファーを加えて調整してください。別のエッペンドルフチューブで、同様の方法ですべてのリバースプライマー（または下流プライマー）を混合します。プライマーミックスが完成したら、PCR MSEミックスを調製します。サンプルごとのすべての検体およびコントロールを記載したプレートマップを作成してください。マスターミックスには、KaiGen multiplex PCR mixを12 µL、各プライマープールを2 µL、およびQ solutionを2 µL含める必要があります。コントロール分を含め、ピペッティングによる損失を考慮して十分な量のマスターミックスを調製してください。マスターミックスを軽く遠心分離します。次に、マスターミックスを18 µLずつPCRプレートの各ウェルに分注します。DNAサンプルのコンタミネーションを防ぐため、手袋を交換し、別のバイオセーフティキャビネットを拭き上げて消毒してください。前述と同様に、フードの除染が完了したら、プレートをそのフード内に移動させます。次に、マスターミックスが入った各ウェルに2 µLのDNAサンプルを加えます。相互汚染を防ぐため、必ずエアロゾル防止ピペットチップを使用してください。PCRプレートを慎重に密閉し、短時間遠心して内容物を混合します。次に、反応プレートをサーモサイクラーにセットし、提出サンプルのPCRプログラムを開始します。フラグメント解析（FLA）では、ホルムアミドサイズ、マスターミックスを準備し、清潔なエッペンドルフチューブに希釈したPCR産物を加え、テストするサンプル1検体あたり12 µLの高純度ホルムアミド溶液と0.3 µLのGeneScan 500 LIDサイズ標準を混合します。この溶液12.3 µLを、96ウェル光学品質反応プレートの各ウェルに分注します。PCR完了後、プレートを遠心分離します。各サンプルの位置がプレートマップに記録されていることを確認してください。次に、別の96ウェルプレートに、1ウェルあたり59 µLのヌクレアーゼフリー水を分注し、そこに各PCR反応液を1 µLずつ加えて、増幅されたDNAを1:60に希釈します。DNAの希釈が完了したら、マルチチャンネルピペットを使用して、希釈した各PCRサンプル1 µLを、ホルムアミド溶液が入ったプレートの対応するウェルに分注します。プログラムが完了した後、標準的なアガロースゲル電気泳動によりサンプルをテストし、予測サイズのDNA断片が増幅されていることを確認できます。サンプルをFLAジェネティックアナライザーによる蛍光キャピラリー電気泳動での分析に備え、分析前にプレートにセプタムを取り付け、短時間遠心して気泡を除去し、サンプルをウェルの底に落とします。IDEによりストランドが化学的に変性するため、加熱変性の必要はありません。プレートをローディングトレイにセットします。ABBI'S genetic analyzer 31 30 xlなどのキャピラリー電気泳動を用いて、ラベル付けされたPCR産物を評価します。分離媒体としてPOP-7ポリマーを満たした50 centimeterのキャピラリーを用いてサンプルを分析します。DNAはキャピラリーの末端に向かって移動し、そこでレーザーと検出器が蛍光ラベルを測定します。アナライザーの収集ソフトウェアを起動してください。サンプルの分析前に、サイズスタンダードを含む、使用するすべての色素を検出できるようにアナライザーを校正する必要があります。これらのサンプルに使用するdsetはABIのG5です。サンプルは1.6 kilovoltsで15秒間、電気泳動的に注入されます。15 kilovoltsを1800秒間印加してフラグメントを分離します。1ランあたりの総所要時間は約45分です。ランが完了したら、各サンプルのデータファイルを作成します。解析装置の収集ソフトウェアにより、ファイルはあらかじめ指定された場所のプレートフォルダに保存されます。ファイル形式はFSA形式です。FLAデータは、Applied Biosystemsのウェブサイトで無料で提供されているピークスキャナーソフトウェアを使用して解析できます。データを分析するには、[start new project]をクリックし、次に[add files]をクリックします。ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを含む、選択したデータファイルをプログラムに読み込みます。読み込まれたファイルを選択して分析します。結果はFLAクロマトグラムとしてプロットされます。サイジングスタンダードはオレンジ色のピークとして表示され、色の付いたピークはサンプル中で解析された各ローカスの細菌DNA検体を表します。ピークをクリックすると、その塩基対サイズを確認できます。DNAポリメラーゼのスリップストランド合成により、一部のマイクロサテライトローカスでは、同じ色のピーク群が検出されます。これらの場合、通常は振幅が最大であるピークを選択します。各サンプルの断片サイズを陽性対照のサイズと比較して、テストした各アレルにタンデムリピートセグメントがいくつ存在するかを判定し、さらなる解析のためにデータをExcelスプレッドシートに記録します。この図では、同じ村の3つの異なる家族に属する7人の患者からの分離株のDNAフィンガープリントが示されており、解析した各多型遺伝子座のタンデムリピート数が表示されています。これらのデータは、家族Bの2人のメンバーが同一株に感染している一方で、もう1人のメンバーは異なる株に感染していることを示唆しています。家族Cのメンバーは、同一株に感染している可能性が高いと考えられます。家族Aのメンバーについても同様です。このビデオを視聴することで、クリニックに来院したハンセン病患者のV-N-T-R-D-N-Aフィンガープリントを取得するために、マルチプレックスPCRとフラグメント解析を日常的に組み込む方法について十分に理解できるはずです。これらは、ハンセン病対策における従来の疫学を補完するための新しい分子ツールです。

dna-fingerprinting-mycobacterium-leprae-strains-using-variable-number

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Immunology and Infection

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出典: Gulla, S. ほか。魚類病原性細菌 Yersinia ruckeri の多遺伝子座可変数タンデムリピート解析(多重PCRおよび毛細管電気泳動による解析)。 J. Vis.

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