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遺伝子サイレンシングに関与するRNAの一種である低分子干渉RNA、またはsiRNAを取り上げます。
リポソームと呼ばれる球状脂質小胞を追加します。
リポソームはsiRNAをカプセル化し、分解から保護します。
神経幹細胞を含む培養ウェルにsiRNA-リポソーム複合体を添加します。コントロールとして1つをよく保管し、インキュベートします。
リポソームは細胞膜と融合し、siRNAを放出します。
siRNAはRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)に結合し、1本の鎖が除去されます。
残りの鎖は細胞分化に関与するmRNAを標的とし、その分解につながります。
ウェルに適切な分化培地を追加します。
対照井戸では、培地中の成長因子およびその他の栄養素が神経幹細胞の骨芽細胞への分化を促進します。
適切な染色技術を使用して、細胞上の骨芽細胞特異的マーカーを染色し、核を青色蛍光色素で染色します。
遺伝子サイレンシング細胞に骨芽細胞特異的マーカーがないことは、それらが分化できないことを示しています。
O9-1細胞でsiRNAノックダウンを実行するには、細胞を回収して播種します。リポソームを適切な量の無血清培地で希釈します。次に、テキストプロトコルに従って無血清培地でsiRNAを希釈します。この後、製造元の指示に従って、希釈したsiRNAを希釈したリポソームに加えます。ピペッティングで溶液を混合し、室温で5分間インキュベートします。
次に、適切な量のsiRNA-脂質複合体を細胞に加えます。次に、標準的な細胞培養インキュベーターで細胞を24時間インキュベートします。O9-1細胞は、特定の分化培養条件下で異なる細胞型に分化することができます。O9-1細胞を骨芽細胞に分化させるには、テキストプロトコルに従って骨形成分化培地を調製します。最後に、免疫染色により、分化した骨芽細胞中の骨芽細胞マーカーオステオカルシンを検出します。
