マウス皮質アストロサイトの3Dバイオプリンティング法

星状細胞懸濁液を取ります。

ゼラチン、光架橋性ゼラチン誘導体、光開始剤、フィブリノーゲン、およびラミニンを含むバイオインク溶液を追加します。

懸濁液を鈍い針で注射器に移します。

バイオインクゲル化のためにシリンジを冷やします。シリンジをバイオプリンターのプリントヘッドに接続します。

針を培養プレートに適切に配置します。設定されたパラメータとデザインでバイオプリンティングを開始します。

アストロサイトを含むバイオインクを針から押し出し、プレート上に層状に堆積させ、アストロサイトを閉じ込めた三次元構造を形成します。

バイオプリントされたコンストラクトを紫外線にさらします。光開始剤はゼラチン誘導体の架橋を助け、生体構築物の安定性を高めます。

トロンビンイオンとカルシウムイオンで治療します。

トロンビンはカルシウムイオンとともにフィブリノーゲンをフィブリンに変換し、安定した3D生体高分子ネットワークに組み立てます。

溶液を廃棄し、バッファーで洗浄して架橋剤を除去します。

アストロサイト培地を加えてインキュベートします。ラミニンはアストロサイトの接着と拡散を助け、アストロサイトが豊富な3D神経様組織を形成します。

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x 10 6細胞/ミリリットルの最終濃度を得るには、1ミリリットルのゼラチン-ゼラチン-メタクリロイル-フィブリノーゲン溶液を細胞を含むチューブに移し、穏やかに上下にピペッティングして均質化します。1000マイクロリットルのピペットを使用して、ゼラチン-ゼラチン-メタクリロイル-フィブリノーゲンバイオインク溶液に置いたアストロサイトを5ミリリットルのプラスチックシリンジにゆっくりと移し、気泡の形成を防ぎます。滅菌された22ゲージの鈍い針をシリンジに接続します。

バイオプリンターを紫外線に15分間さらしてから、バイオプリンターを70%エタノールで拭きます。次に、シリンジをバイオプリンターのプリントヘッドに接続し、バイオインクを手動で洗い流して残りの気泡を取り除きます。

バイオプリンティングを行うには、バイオプリンターテーブルに35mmの培養皿を置きます。針を培養皿の表面から0.1ミリメートル離して針を動かし、印刷ボタンを押します。バイオプリンティングが終了したら、シリンジが皿から離れていることを確認し、培養皿を閉じます。培養皿をUV光の下に置き、ゼラチン-メタクリロイル架橋を行います。

滅菌スパチュラを使用して、バイオプリントされたコンストラクトを24ウェルプレートに移し、500マイクロリットルのトロンビン塩化カルシウム溶液を加え、フィブリン架橋を可能にするために30分間放置します。架橋溶液を除去した後、コンストラクトを2ミリリットルのPBSで洗浄します。次に、PBSを1ミリリットルのアストロサイト培地に置き換えます。摂氏37度、二酸化炭素5%でインキュベートし、3日ごとに培地を交換します。