Name: 頭蓋放射線療法によって引き起こされた認知機能障害の回復のための細胞移植戦略を幹 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: 学ぶ、頭蓋放射線療法後の認知機能障害に対する神経幹細胞移植法。athymicラットの海馬への正確な細胞注入と移動評価の再現性あるプロトコルを確立し、神経発生回復の臨床応用に向けた枠組みを提供します。

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

かなりの研究が進められて幹細胞は、損傷を受けた高齢者や病気の組織8に通常の機能を復元するために臨床的に使用することができる方法の無数を模索している。これらの取り組みの最終的な実現には、無傷の正常組織とは異なるユニークな微小環境内で移植細胞の挙動の詳細な理解が必要になります。私たちの仕事は、照射組織のベッドの中で、頭側で移植したのNSCが機能的に彼らは、生き残る移行し、神経やグリア系統2に沿って区別認知を、復元できることが実証されています。正確にこれらの細胞は、認知の回復を仲介する方法現在のところ不明であるが、再現可能な方法で慎重に制御実験一連の手順を行うに依存しません。我々は、関連付けられている有害な認知効果を改善するための幹細胞治療のトランスレーショナル可能性を促進するための努力でここでこれらの重要な手順を詳しく説明している癌の脳と他の形態の臨床管理。データの質の深刻な影響が出る可能性がある追加の考慮事項を以下にハイライトされています。 移植ベースの治療は重要な試薬としての幹細胞に依存し、それに応じて、ケアが適切に、文化を特徴づける無菌性を維持し、結果の信頼性をマッチの通路番号を使用するために行使する必要があります。移植されたヒト幹細胞を生体内でそれらを追跡するための一つの手段を提供するために、手術前にBrdUで標識した。我々の実験条件下では、移植のNSCは、BrdUの標識の希釈には問題はなかったように、広範な増殖を受けなかった。また、移植されたヒト幹細胞は、核マトリックス蛋白質（H - NUCまたはhNUMA）9またはヒト特異的核抗原（HuNu）2などのヒト特異的マーカーの免疫染色により宿主の細胞と区別することができます。ヒト幹細胞はまたで標識することができますホストの脳内でそれらの識別を容易にするために蛍光マーカーの様々な。 照射のパラメータに注意し正確な用量の配信方法を定義し、それらはここで、放射線腫瘍学のモデル、現在の臨床実践を説明した。脳内の幹細胞の再現性の移植も重要です、そしてデジタル定位固定装置を使用して行われます。正確には海馬のような小さな脳の構造の幹細胞移植のためのマイクロシリンジをmicromanipulateする機能が大幅にヒューマンエラーを減らします。この装置では、NSCのは、ラットの海馬の後部地域に前方に広がる四季のサイトに移植した。背腹（DV）の座標は、外科手術は、海馬体2へのダメージが発生しないことなど無胸腺ヌード（ATN）ラットの経験に基づいて決定した。ラットの脳の冠状断面では、海馬体の税込のキー構造を明らかに歯状回（DG）、歯状門（DH）とCA1とCA3サブフィールド（ 図8）uding。暗く染色（茶色）細胞がちょうどその後septoを通して移行する脳梁（CC）、下に移植リリースサイト（TR）で蒸着として目に見える針の管（NT、赤線）から背側に導入された移植のNSCは、可視化海馬の - 時間軸。

<table border="1"><tbody><tr><td> 材料名 </td><td> タイプ </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>デジタル定位の音源w/45 °と18 ° Earbars </td><td>頭蓋移植外科セットアップ</td><td>ライカマイクロシステムズ（以前：MyNeuroLab） </td><td> 39463501 </td><td>便利な付属品：ヒーターと可変電流源とステージ（手術中の体温を維持するために） </td></tr></tbody></table>

頭蓋放射線療法によって引き起こされた認知機能障害の回復のための細胞移植戦略を幹

Stem Cell Transplantation Strategies for the Restoration of Cognitive Dysfunction Caused by Cranial Radiotherapy

放射線治療は、しばしば原発性または転移性脳腫瘍で苦しむ人のための唯一の臨床頼みの綱が用意されています。有益な一方で、頭蓋照射は、部分的に、神経幹細胞の枯渇が原因である可能性があります認知における進行性の衰弱低下を誘発することができます。脳腫瘍と診断された患者の生存率の増加を考えると、認知の健康の面で生活の質は、特に、任意の満足のいく長期的な治療法がない状態で、ますます重要な課題となっています。 我々は放射線誘発認知機能の低下と戦うための戦略として、幹細胞の置換を使用しているこの深刻な健康上の懸念に対処する。我々のモデルは、全脳照射を受けた無胸腺ヌードラットを使用しています。電離放射線は、定位放射線手術を基づいて、 林の耳ccelerator（LINAC）のいずれかを介して脳全体として、あるいは海馬に非常に集束ビームとして配信されます。照射後の二日間、胡人間の神経幹細胞（hNSCs）は定位的海馬に移植した。ラットは、移植した細胞の生存、認知​​の変化を評価し、照射後の分化特異的マーカー1と4ヶ月の発現のためにされた。私たちの認知テストのパラダイムは、hNSCsを移植した動物は、認知機能の大幅な改善を示すことを明らかにした。公平な立体学は1から移植細胞の有意な生存率（10-40％）を明らかにし、4ヵ月移植後、移植細胞の量と種類に依存します。移植細胞が広範囲に移行し、グリアと神経系統に沿って分化する、と未熟と成熟した表現型マーカーの範囲を表現する。 私たちのデータでは、この手順は一日頭蓋radiotを受けた個人の認知の長期的な機能回復のための有望な戦略を買う余裕ができることを示唆し、生着したヒト幹細胞由来の直接認知の利点を実証するherapy。我々の研究を複製し、拡張するために必要な重要な手続きの普及を推進するために、定位radiosurgeyと移植に重点を置いて、我々の実験計画では、いくつかの重要な手順の書かれ、視覚的なドキュメントを提供している。

脳腫瘍の患者は定期的、および認知機能障害を衰弱に有益な、この治療法はしばしば結果ながら、頭蓋放射線治療を受ける。この重大な未解決問題は、現時点では臨床的遡求権を持たず、放射線誘発認知減分を回収するための幹細胞ベースの治療法を考案する努力を推進してきました。

放射線治療は、原発性または転移性脳腫瘍に罹患した患者にとって、しばしば唯一の臨床的な手段となります。頭蓋照射は有益である一方で、...

本実験の全体的な目的は、海馬へ幹細胞を再現性高く移植することである。まず、脳腫瘍の臨床管理で起こり得る状況をシミュレートするため、胸腺欠損ラットに定位放射線治療を施す。研究室では、移植に向けてヒト神経幹細胞を培養し、通常、ラット1匹あたりの治療に1 million cellsを必要とする。照射の2日後、幹細胞を海馬の正確な位置にゆっくりと注入します。最終的に、このプロトコルでは移植された幹細胞が海馬全体に遊走することが示されます。私は、頭蓋内照射後の神経新生の抑制を回復させるために幹細胞を利用する可能性を検討し始めたとき、初めてこれらの手法を考案しました。一般的に、この手法を用いる者は困難に直面することが知られています。なぜなら、幹細胞の増殖は容易ではなく、抗生物質フリーの増殖条件下で日々細心の注意を払った管理が必要だからです。本手順を視覚的に提示することで、小さく明確に定義された脳領域に精密な照射を行うための画像再構成に用いられる臨床プロセスが明確になります。照射手順のデモンストレーションは、当科の臨床教授であるDante Rowa博士が担当します。幹細胞の調製は、私の研究室の技術者であるMary Land氏とCatherine Tran氏が担当し、移植に必要な手順は、博士研究員であるMuja博士がデモンストレーションします。治療前の正確な動物のポジショニングには画像誘導放射線治療ソフトウェアを、また脳の他部位への放射線損傷を最小限に抑えた標的照射には強度変調放射線治療を利用します。MRIスキャンから24時間後、鎮静化した動物を放射線腫瘍学用CTスキャナーに配置し、別の断層画像ボリュームを生成します。ラットをMRIスキャン時と同じ位置に配置し、CT装置を頭蓋骨領域のスキャンに設定して、CT治療計画データを生成します。画像厚0.8 mmで106枚のCT画像を取得します。次に、MRIおよびCTの画像データをEclipse治療計画ソフトに転送します。Eclipseを使用して、骨構造および軟部組織のマッチングに基づき、MRIとCTデータの融合（フュージョン）を行います。このステップに要する時間は変動し、画像の品質によって1時間から3時間かかる場合があります。満足のいく画像融合が得られたら、照射対象領域および隣接する重要臓器の輪郭を抽出します。照射は全脳に行うことも、個々の海馬などの特定の体積領域に限定して行うことも可能です。輪郭描出（コントゥアリング）によって、これらの臓器の位置だけでなく、線量分布を最適化する上で極めて重要な体積情報が得られます。線量分布を最適化するため、Eclipseの線量最適化ウィンドウに、標的線量、標的適合度、および重要臓器への線量制約に関する情報を入力してください。プランが生成されると、Eclipseは計算された線量を軸位断、冠状断、および矢状断画像に重ね合わせて表示し、さらに線量体積ヒストグラム形式でも提供します。この時点で、プランを評価し、照射に適しているか、あるいは改善が必要かを判断する必要があります。照射工程を開始するために、鎮静化したラットをペーパーブランケットの下に置き、保温します。数分後、毛布で覆われたラットを放射線治療用リニアアクセラレーターの治療テーブル上に配置しますが、頭蓋骨は露出させておいてください。CTスキャン時に使用した位置と同じ位置に配置するようにしてください。この手順は、線量照射の正確性を確保するために極めて重要です。次に、放射線治療用リニアックに搭載されているイメージングシステムを用いて、鎮静化したラットの直交X線画像を撮影します。これらの直交X線画像をEclipseによって提供されるリファレンス画像セットに共登録し、適切な画像アライメントのために必要な位置補正を行います。単一側の海馬に対しては6フィールドのIMRTプランを用いて10 Gyの線量を照射し、両側の海馬に対しては2アークのRapidArcプランを用いて照射します。治療完了後、動物を治療室から搬出し、加温保持ケージ内で回復させます。手術の準備として、麻酔をかけたA TNラットの頭部の被毛を電気バリカンで除去します。ラミナーフローフード内で、ポビドンヨードと70% ethanolを繰り返し塗布して、除毛した部位を洗浄します。脳定位固定装置、マイクロドリル、ドライベッド滅菌器、およびコントローラーを準備します。動物を加熱台の上に置き、手術中は保温してください。手術前および手術中は滅菌手袋を着用し、70% ethanolを噴霧します。手術器具は専用の層流クリーンベンチ内で管理します。無菌状態を維持するため、頭部のみが露出するように、動物を小さな手術用ドレープで覆います。外耳道にイヤーバーを挿入し、動物の頭部を脳定位固定装置にしっかりと固定します。イヤーバーの先端を外耳道に挿入する際は、細心の注意を払ってください。ラットの上切歯を引っ掛け、バーの高さを標準的な基準点に合わせてインサイザーバーを設置します。次に、ノーズクランプを締めます。耳用バーの間で頭の位置を中央に合わせ、側方向の動きを最小限にしてステレオタキシス上のゼロ点に設定します。動物を固定した後、乾燥を防ぐために眼用潤滑軟膏を塗布します。手術中にさらに一度、軟膏を塗布してください。滅菌メスを用いて、頭皮に沿って正中線に2 cmの皮膚切開を行います。滅菌綿棒を用いて患部を清浄します。次に、骨膜を広げた状態で保持するために解剖用リトラクターを挿入します。出血がある場合は、その部位を強く圧迫してください。1%過酸化水素に浸した綿棒を使用して、縫合線であるbgmaとlambdaが見えるまで、頭蓋骨を覆っている軟部組織を除去します。脳定位手術において最も困難な点は、定位固定装置内で動物の頭部を正確に配置することです。動物の頭蓋骨上に正確な定位座標を標記するため、ラット脳アトラスを用い、本研究ではB bgmaを基準として正確な定位座標を決定します。幹細胞移植は、頭蓋骨上の位置を特定するために以下の定位座標を用いて、4つの異なる部位に行います。まず、bgmaを特定してください。次にゼロ点合わせを行います。デジタルディスプレイコントローラー上の3つの座標すべてをゼロにします。ゼロ点合わせ後、あらかじめ決定した座標を用いて移植部位を特定し、フレームのプローブホルダーに取り付けた極細マーカーで印を付けます。ドリルを使用して、印を付けた各箇所に0.35 millimeterの穴を頭蓋骨に開けます。硬膜を損傷しないよう注意してください。ドリリング中に出血が生じた場合は、綿棒を用いて強く圧迫してください。これで動物の移植準備が整いました。移植に使用するヒト神経幹細胞は、あらかじめ調製し、使用するまで氷上で保持しておいてください。準備ができたら、5 µLの30ゲージ Hamilton マイクロシリンジに細胞懸濁液を充填します。充填済みのシリンジを、立体定位装置の小型プローブホルダーに取り付けます。正しい位置に移動させた後、針先を頭蓋骨の穴に慎重に挿入し、脳表面に到達させます。デジタルディスプレイコントローラーのDV座標をゼロに合わせ、その後、目的の深さまでゆっくりと針を挿入します。針を1分間そのまま保持します。その後、0.25 µL/minの速度で、合計1 µLの細胞を注入します。注入内容物が針の経路を 통해毛細管現象で逆流するのを防ぐため、針を抜く前に8分間そのまま保持します。その後、移植部位から0.5 mm/minの速度でゆっくりと針を後退させます。残りの移植部位についても、この手順を繰り返します。注入が完了したら、皮膚牽引器を取り外し、鈍端ピンセットを使用して皮膚を頭蓋骨の上にゆっくりと戻します。手術後、4〜5個の滅菌ステンレスクリップを用いて創傷を閉鎖します。動物を加温ケージに入れ、回復状態を観察します。移植から1か月後、脳サンプルを切片化し、移植されたNSCSを検出するためにBRDUで染色し、ヘマチンで対比染色を行いました。赤線で示された針の経路は、図に見られるようにTRと指定された移植放出部位にNSCSを導入した注射軌道を示しています。ここでは、移植されたNSCSが、海馬の脳梁およびCA1領域から、歯状回およびCA3領域へと広範囲にわたって遊走したことが示されました。得られたMRI画像セットを、対応するCT画像セットに正確に照らし合わせて使用することが重要です。治療手順の前に海馬領域を特定し、その後の輪郭描画を行うには、適切な画像融合が不可欠であり、動物が正確に配置されているかを確認するために直交X線画像を取得してください。移植を成功させるため、常に滅菌された手術環境を維持してください。Otaxの座標を正確にマークし、注入後は液体の逆流を防ぐためにマイクロシリンジをゆっくりと抜きます。このビデオを視聴することで、選択した動物モデルを用いて臨床的に関連のある放射線処置を行う方法と、脳の正確な領域に幹細胞を外科的に移植する方法について、十分に理解できるはずです。

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