頭蓋放射線療法によって引き起こされた認知機能障害の回復のための細胞移植戦略を幹

次の実験の全体的な目標は、幹細胞を海馬に再現性よく移植することです。まず、胸部ラットに定位放射線療法を施し、脳腫瘍の臨床管理中に何が起こるかをシミュレートします。研究室では、移植のためにヒト神経幹細胞を培養しますが、ラット1匹の治療には通常100万個の細胞が必要です。

照射の2日後、幹細胞は海馬の正確な位置にゆっくりと注入されます。最終的に、このプロトコルは、移植された幹細胞が海馬全体に移動することを示しています。私は最初にこれらの方法論のアイデアを持っていたのは、頭蓋照射後、神経新生の阻害を逆転させるために幹細胞を使用する見通しを検討し始めたとき、一般的に、幹細胞の成長は些細なことではなく、抗生物質を含まない成長条件下での毎日の注意とケアを必要とするため、この方法に苦労することを知っていた個人

この手順を視覚的に示することで、小さくて明確に定義された脳の体積を正確に照射するための画像再構成に使用される臨床プロセスをわかりやすく説明します。照射手順を実演していただくのは、私の学科の臨床教授であるダンテ・ロワ博士です。幹細胞の作製については、私の研究室のMary LandさんとCatherine Tranさんの技術者が実演し、ポスドクのMuja博士が移植に必要な手順を実演します。

治療前に動物の正確な位置決めを行うには画像誘導放射線治療ソフトウェアを、脳の他の部分への放射線損傷を最小限に抑えた標的照射には変調放射線治療を利用します。MRIスキャンの24時間後に、鎮静した動物を放射線腫瘍学のCTスキャナーにセットすることで、別の断面画像ボリュームを生成します。ラットをMRIスキャンに使用したのと同じ位置に置き、CTユニットを頭蓋骨領域をスキャンするように設定して、CT治療計画データを生成します。

画像厚み0.8mmのCT画像を106枚取得します。次に、MRIとCTの画像データをEclipse治療計画ソフトウェアに転送します。Eclipseを使用して、骨の解剖学的構造と軟部組織のマッチングに基づいてMRIデータとCTデータを融合します。

これは時間変数のステップであり、画質によっては、このプロセスに1時間から3時間かかる場合があります。満足のいく画像融合が得られたら、照射するターゲット領域と隣接する重要な臓器の輪郭を描きます。照射は、脳全体に照射することも、個々のカバカンピなどの特定の体積領域に限定することもできます。

等高線は、これらの臓器の位置だけでなく、線量分布を調整するために重要な体積情報も提供します。線量分布を調整するため。Eclipseの用量最適化ウィンドウに、重要な臓器に対する目標用量、目標適合性、および用量制約に関する情報を入力します。

計画が生成されると、Eclipseは、軸方向の冠状および矢状画像に重ね合わせて計算された線量を、線量ヒストグラム形式で提供します。この時点で、計画を評価して、配送に適しているか、改善する必要があるかを判断する必要があります。照射プロセスを開始するには、鎮静剤を施したラットを紙の毛布の下に置いて保温します。

数分後、ラットを毛布で覆われた放射線治療線形加速器の治療台に置きますが、頭蓋骨が露出しています。CTスキャンの生成に使用したのと同じ位置に必ず配置してください。このステップは、線量送達の精度を確保するために重要です。

次に、放射線治療用線形加速器に搭載されたイメージングシステムを用いて、鎮静ラットの直交X線画像を取得し、Eclipseが提供する参照画像セットに直交X線画像を共登録し、適切な画像位置合わせに必要な位置補正を行います。1つの海馬のための6フィールドIMRT計画と両方の海馬のカンピ照射のための2アーク急速アーク計画で10グレードの線量として照射を送達します。治療の送達が完了したら、治療室からラップを取り出し、加熱された保持ケージで回復させます。.

手術の準備として、麻酔をかけたA TNラットの頭部から毛皮を取り除くために電動バリカンを使用します。層流フード内で作用するポビドンヨードと70%エタノールを繰り返し塗布して、剃った部分をきれいにします。脳定位固定装置、マイクロモルドリル、乾床滅菌器、コントローラーを準備します。

手術中は、動物を加熱した面に置いて保温してください。滅菌手袋は、手術前および手術中ずっと着用し、70%エタノールを噴霧します。手術器具は、専用の層流フードで維持されます。

無菌状態を維持するために、頭だけが露出するように動物を小さな外科用ドレープで覆います。動物の頭を脳定位固定装置フレーム内にしっかりと配置するには、耳バーを外部聴覚アツに挿入します。エアバーの先端を外耳道にスライドさせるときは、細心の注意を払ってください。

ラットの上切歯を引っ掛け、バーの高さを標準基準点に調整して、切歯バーを配置します。次に、ノーズクランプを締めます。頭の位置をイヤーバーの中央に配置し、横方向の動きを最小限に抑えて、脳定位ゼロを達成します。

動物が所定の位置に配置されたら、乾燥を防ぐために潤滑性の眼軟膏を塗布します。手術中にもう一度軟膏を塗ります。滅菌メスを使用して、頭皮に沿って2センチメートルの正中線の皮膚切開を行います。

滅菌綿の先端アプリケーターを使用してその部分を清掃します。次に、解剖リトラクターを挿入して骨膜を開いたままにします。出血が発生した場合は、その部分にしっかりと圧力をかけてください。

1%の過酸化水素に浸した綿の先端のアプリケーターを使用して、縫合糸bgmaとラムダが見えるまで頭蓋骨を覆っている軟組織を取り除きます。脳定位固定術の最も難しい点は、動物の頭部を脳定位固定装置のフレームに正確に配置することです。動物の頭蓋骨に正確な定位固定装置座標をマークするには、ラップ脳アトラスを使用して正確な定位座標を決定します この研究では、幹細胞移植は、次の定位固定装置座標を使用して 4 つの異なるサイトで行われ、頭蓋骨上の位置をマークします。まず、bgma を特定します。

ネクストゼロ。デジタルディスプレイコントローラー上の3つの座標すべて。ゼロになったら、所定の座標を使用して移植部位を特定し、フレーム上のプローブホルダーに取り付けられた細かいポイントマーカーでマークを付けます。

ドリルを使用して、マークされた各場所で頭蓋骨に0.35ミリメートルの穴を開けます。ダーラムメンブレンの損傷を防ぐように注意してください。穴あけ中ににじみが発生した場合は、綿の先端のアプリケーターを使用してしっかりと圧力をかけます。

これで、動物は移植の準備が整いました。移植に使用するヒト神経幹細胞は、事前に準備し、必要になるまで氷上に保管する必要があります。準備ができたら、5マイクロリットルの30ゲージハミルトンマイクロシリンジに細胞懸濁液を入れます。

充填されたシリンジを脳定位固定装置フレームの小さなプローブホルダーに取り付けます。正しい位置に移動したら、針の先端を脳の表面に到達するまで頭蓋骨の穴に慎重に挿入します。デジタルディスプレイコントローラーのDV座標をゼロにしてから、針を目的の深さまでゆっくりと挿入します。

針を1分間所定の位置に保ちます。この時間の後、毎分0.25マイクロリットルの速度で合計1マイクロリットルの細胞を注入します。注射内容物の毛細血管逆流を防ぐために、針を引っ込める前に8分間所定の位置に保持します 針トラックを通って針を移植部位からゆっくりと引っ込めます 毎分0.5ミリメートルの速度で。

残りの移植部位についてこの手順を繰り返します。注射が完了したら、スキンリトラクターを取り外し、鈍いピンセットを使用して皮膚を頭蓋骨の上にそっと引き戻します。手術後、4〜5個の滅菌ステンレス製クリップを適用して傷を閉じます。

動物を加熱されたケージに入れ、その回復を監視します。移植の1か月後、脳サンプルを切片にしてBRDUで染色し、移植されたNSCSを検出し、ヘマチンで対抗染色しました。ここで赤い線で表されている針の軌跡は、TRと指定された移植放出部位にNSCSを沈着させた注射軌跡を示しています。

ここでは、移植されたNSCSは、海馬のコーパスコッサムおよびCA one領域からdente gyrusおよびca three領域への広範な移動を示しました。取得したMr.I画像セットは、対応するCT画像セットに対して正確に使用することが重要です。適切な画像融合は、治療手順の前に海馬領域の識別とその後の輪郭形成に重要であり、動物が正確に位置していることを確認するためにX線画像を取得または直交します移植の成功を確実にするために、常に無菌の外科的環境を維持します。

Otaxの座標を正確にマークし、注入後にマイクロシリンジを徐々に取り外して、流体の逆流を防ぎます。このビデオを見れば、選択した動物モデルを使用して臨床的に関連性のある放射線治療を行うことや、幹細胞を脳の正確な領域に外科的に移植する方法を十分に理解できるはずです。