JoVE 実験百科事典
神経科学
0 回視聴 • 4:48 分 • July 8th, 2025
髄神経が豊富な環境におけるグリア前駆細胞に由来する腫瘍であるびまん性内因性橋神経膠腫を含む脳幹組織断片から始めます。
タンパク質分解酵素で処理して、組織の細胞外マトリックスを分解します。
インキュベーション後、内容物を繰り返しピペットで移動させ、細胞の解離とミエリン鞘の分解を促進します。
ろ過して遠心分離して細胞を回収します。上清を取り除き、コールドバッファーに再懸濁します。
密度勾配分離用のスクロース溶液を加え、完全に混合します。
次に、遠心分離して、軽いミエリン破片から重い細胞を分離します。
ミエリン層を取り除き、赤血球溶解バッファーを追加します。
コールドバッファーを加えて溶解作用を停止します。遠心分離して上清を除去し、溶解した赤血球を除去します。
細胞を温かい神経基底培地に再懸濁し、コーティングされていないフラスコで培養します。
神経向性因子の欠如は神経細胞の死を引き起こしますが、グリア前駆細胞は栄養素と成長因子を利用して増殖を引き起こします。成長因子レベルを維持するために、新鮮な培地を追加します。
時間が経つにつれて、これらの細胞は自発的に細胞クラスターに凝集し、自由に浮遊する神経球を形成します。
この手順では、残りの組織断片を含む円錐形のチューブを5分間遠心分離します。その後、上清を取り除き、組織1ミリリットルごとに5ミリリットルの消化液になるように予熱した酵素消化液を加えます。次に、円錐形のチューブの蓋を実験用フィルムで密封し、摂氏37度の回転器で反応を30分間インキュベートします。
インキュベーション後、サンプルを穏やかに粉砕します。10ミリリットルの血清学的ピペットを使用して、サンプルを上下に6〜8回ピペットし、過剰な気泡の発生を避けます。次に、1000マイクロリットルのピペットチップをピペットの端に追加し、サンプルをさらに6〜8回粉砕します。
残りの塊をチューブの底に落ち着かせます。次に、細胞を100ミクロンのフィルターで浮遊させたままの上清を取り出し、酵素解離と標識された新しい50ミリリットルの円錐形チューブに濾過し、氷上に保存します。その後、酵素解離チューブを5分間遠心分離し、スクロース勾配遠心分離を続けます。サンプルがまだ溶液中に懸濁している場合は、5分間遠心分離します。
次に、上清を除去し、カルシウムとマグネシウムを含まない20ミリリットルの冷たいHBSSに組織を再懸濁します。次に、コールドHBSSで容量を最大25ミリリットルにします。ゆっくりと、25ミリリットルの1.8モルスクロース溶液を加え、チューブを反転させて混合します。これにより、0.9モルのスクロース勾配が得られます。
その後、サンプルを10分間休憩せずに遠心分離します。ミエリンの破片とできるだけ多くのスクロース溶液を慎重に吸引します。次に、カルシウムとマグネシウムを含まない30ミリリットルの冷たいHBSSを加え、穏やかに混合してサンプルを洗浄します。その後、5分間遠心分離します。
この手順では、洗浄上清を取り除きます。5ミリリットルのACK溶解バッファーを加え、細胞ペレットを穏やかに再懸濁し、室温で1分間チューブを回転させます。次に、カルシウムとマグネシウムを含まない30ミリリットルの冷たいHBSSを加えて溶解を急冷します。
その後、5分間遠心分離します。最終細胞ペレットを成長因子を含む10〜15ミリリットルの温かい完全TSMに再懸濁し、トリパンブルー除外を使用して血球計算盤で生細胞密度を定量します。その後、最終的な細胞懸濁液を新しいT75培養フラスコに移します。成長因子を一日おきに追加して、全体的な成長因子レベルを維持し、腫瘍細胞神経球の発達を監視します。