マウスの内耳からの前庭神経節ニューロンの分離

ネズミの子犬の頭の半分を取り、脳を取り除きます。

頭蓋骨の上部を切断し、周囲の組織を切除して、内耳構造を保護する骨の外層である耳嚢を視覚化します。

組織を緩衝培地を含む培養プレートに移します。

前庭神経細胞体を含む上前庭神経節と下前庭神経節を分離します。

骨の隆起を削り取り、下にある上神経節を採取します。

上神経節を緩衝培地を含む新しいプレートに移します。

表面から付着組織を取り除き、孤立した神経節を洗浄します。

神経節をタンパク質分解酵素を含む溶液に入れます。

酵素は組織の細胞外マトリックスを分解し、細胞を緩めます。

神経節を培地を含むポリマーコーティングされたガラス底皿に移し、組織を機械的に解離して細胞を放出します。

イン

キュベートし、細胞が付着して前庭神経節ニューロン培養を確立できるようにします。

閉じた手術用ハサミを使用して、安楽死させたマウスの脳をすくい取ります。脳神経を切断して除去し、脳を頭蓋骨から完全に切り離します。後頭部から始めて、鉗子で透明な膜状の材料を引き抜き、手術用ハサミを使用して頭蓋骨の上部を切り取ります。

頭と首の後ろから余分な組織を取り除き、解剖領域と耳嚢をよりきれいにし、アクセスしやすくします。組織を新鮮なL-15溶液で2番目のペトリ皿に移します。次に、耳嚢と聴覚神経、上前庭神経、下前庭神経を見つけます。小さなバネハサミで上神経節と下神経節を分離し、聴覚神経を切り取ります。

メスを使用して、骨の隆起をそっと削り、神経が骨の包に潜る骨領域を弱めます。メスで破片を慎重に取り除き、神経節の腫れた部分全体を露出させます。

細いバネはさみを使用して、卵形嚢に向かって潜っている末梢神経枝から神経節を切断して分離します。細い鉗子を使用して上神経節を取り除き、新鮮なL-15溶液を入れた35ミリメートルのペトリ皿に移します。

酵素溶液を予熱した後、酵素混合物を35ミリメートルのペトリ皿に注ぎ、摂氏37度のインキュベーターに10〜15分間入れます。細い鉗子と小さなバネハサミを使用して、骨、余分な組織、神経線維、その他の余分な構造を取り除き、神経節をきれいにします。神経節組織の除去を最小限に抑えるように注意してください。

洗浄した神経節を予熱した酵素溶液に移し、インキュベーターに10〜40分間戻します。次に、神経節を新鮮なL-15溶液を入れた35ミリメートルのペトリ皿に移します。

2〜3分後、神経節をろ過された培地で満たされた別の35ミリメートルのペトリ皿に移します。約150マイクロリットルのろ過された培地をコーティングされたガラス底皿に移します。次に、必要な数の神経節をカバーガラスに移します。

培養皿から少量の培地を引き出し、組織がガラスピペットの側面にくっつかないように、粉砕ピペットを培地ですすぎます。神経節が十分に解離するまで、組織をピペットに穏やかかつ繰り返し通すことによって粉砕します。

5分後、光学顕微鏡で細胞がカバーガラスに沈殿したかどうかを確認します。培養皿を摂氏37度のインキュベーターに12〜24時間慎重に入れます。