微細加工後のアレイ検出器（mPADs）：機械的な力を単離するためのアプローチ

こんにちは、私はネイサン・スナイア・デッキーで、今日はウェス・ライガンとロビー・デサイとマイク・ヤンです。私たちは、ここペンシルベニア大学のクリス・チェンの研究室の出身です。このビデオでは、微細に加工された一連の投稿を使用して細胞の引力を測定するアプローチを紹介します。

牽引力は、ミオシンとアクトンの相互作用によって生成され、私たちの生理機能に重要な役割を果たしています。発生中、それらは細胞が私たちの組織の初期構造を形成するために、ある場所から次の場所に移動することを可能にします。また、傷口を塞いだり、白血球が体内を移動したり這ったりするために必要なため、治癒過程にも役立ちます。

しかし、残念ながら、これらの同じ力は、癌の転移または腫瘍への血管の成長の場合、私たちの健康に悪影響を与える可能性があります。そのため、これらの牽引力を定量的に、特に個々の細胞のミクロスケールやナノスケールで実際に測定できる方法はほとんどありません。in vitroで細胞を研究する一般的な方法のほとんどは、ガラス底皿やポリスチレン皿を使用するものでしたが、これらは非常に硬い基板であり、そうではなく、細胞が引き起こす牽引力や名誉毀損を実際に物理的に測定することはできません。

そのため、何らかの物理的な読み出しなしに、牽引力の根底にあるメカニズムを理解することは非常に困難でした。ですから、クリス・チェンの研究室では、これらの制限を克服するための技術があります。私たちの方法は、柔軟なカンチレバーの垂直配列に基づいており、その剛性とサイズスケールは、個々の細胞が複数のカンチレバーに広がり、その過程でそれらを偏向するようなものです。

私たちが最も頻繁に使用する寸法は、直径3ミクロン、直径の円筒形の支柱、高さ10ミクロン、中心から中心までの間隔が9ミクロン、長方形の配列です。ただし、これらの寸法は、さまざまな細胞研究に対応するために変化させることができます。まず、こちらでご覧いただけるリジッドシリコンマスターから始め、次にそれらをこちらでご紹介するフレキシブルPDMSカンチレバーに変換します。

この手法を使用して、顕微鏡下で個々のカンチレバーのたわみを測定し、そのようなたわみを生成するために必要な大きさと方向で細胞の牽引力を元に戻すことができます。これらの基板をマイクロポストアレイ検出器用のMパッドにしましたが、このビデオでは、シリコンマスターからPDMS複製、そして最後に変調と細胞収縮の計算まで、Mパッドの製造方法を示します。こんにちは、ここに私たちは研究室のクリーンルームにいます。

これは、シリコンマスターとして機能するSUの8つのポストを作成することを可能にする、ほこりのない光に敏感な部屋です。まず、シリコンウェーハから始めて、これを使用してSU 8のフォトレジスト、SU 8のネガティブレジストでコーティングします。したがって、このフォトマスクを通して光を当てると、光がマイクロポストをパターン化して3次元構造を形成し、それがPDMSでキャストするSU8ポストになります。

ですから、すべての処理を終えると、ウェーハはこのようになりますが、そこにはマイクロピラー、つまりすでにウェーハに製造されたマイクロポスト構造があります。そこで、マスターを作るために、まずベアシリコンウェーハから始めて、これをオゾン処理で7分間洗浄し、さらにこのウェーハを摂氏120度で30分間脱水しました。これにSU eight 2002を回転させて、支柱の非常に薄いベースレイヤーを形成します。

SU 8を回転させるので、ガスマスクを着用し、ウェーハをこのホルダーにリロードし、そこにある可能性のあるほこりを取り除き、スピナーに置き、中央にあることを確認し、その上にSU8 2002を注ぎます。そして、先に進んでウェーハを回転させます。次に、これらをホットプレート、ソフトベイクに置きます。

その後、これを1分間行います。次に、それを取り、95度のホットプレートに移します。これを2分間行います。

そして、それが終わったら、これを今持って、マスクアライナーでフラッドエクスポージャーを行います。さて、このウェーハ上でSU8の最初の層であるSU8を回転させたところですが、今度はウェーハ全体をフラッドエクスポージャーして、マイクロポストの最初のベースレイヤーを作成する必要があります。ですから、この70ミリジュールのエクスポージャーを与える必要があります。

したがって、ここでマスクアライナーの光の実際の強度を測定する必要があります。そこで、メーターをウェイトに積み込み、マスクアライナーにセットします。次に、光を当てます。

こちらはUVライトです。シリコンウェーハをマスクアライナーにセットし、マスクアライナーに入れます。また、今回はマスクがないので、フィルム全体を露出させることができます。

シャッターを切って、露出を1分間ダイヤルアップして、露出を始めましょう。したがって、システムが1分後には、ウェーハを取り出します。そして今、露出後のベイクを行う必要があります。

さて、このウェーハを露出させたばかりで、今度はSU8の最初のコーティングで架橋反応を起こすために熱を加えます。そこで、65度のホットプレートに1分間置き、次に95度のホットプレートに2分間移します。2分間のプロセスの後、ホットプレートをオフにして、ウェーハを室温に戻します(これには約30分かかります)。

そこで、このウェーハ上にSU8の2番目の層を回転させました。そして今、これをフォトマスクを通して実際に露出させる必要があります。今回は、UVフィルターを使用して、その深いUV光を遮断します。

こちらはHOYAの光学ガラスですが、今回は再度強度を測定する必要があります。そこで、露出計を使用するか、上部のフィルターを使用して、フィルターで除去された強度を測定します。次に、マスクをマスクアライナーにロードします。

このスイッチは、マスクを所定の位置に保持する真空を作り出します。次に、マスクアライナーに配置します。次に、フィルターを上に置き、ウェーハをロードします。

接触が良好であることを確認したいので、接触するように持ち上げてから露光を開始し、露光後、ウェーハをマスクアライナーから取り出します。ですから、今では選択的に曝露された領域があります。これをオーブン、ホットプレートに持って行き、露出後の焼き付けを行います。

露光後のベイクであるPOを行ったところですが、今度はこのウェーハを開発して、実際に3次元構造を取得できるようにします。私たちがやろうとしていることは、これを洗浄し、これをP-G-M-E-Aで現像し、露出していないSU8を洗い流すことです。そこで、まずP-G-M-E-Aの1つの皿から始めて、ここにウェーハを2分間座らせ、軽く攪拌します。

では、これを2分間放置します。そこで、P-G-M-E-Aの2皿目に移します。これにより、飽和したP-G-M-E-AがSU8で除去されます。

10秒後、IPAに持ち込みます。これにより、P-G-M-E-Aが洗い流されます。ここに20秒間入れ、再び軽い攪拌を加えます。

そして今、私たちは自立型のポスト構造を持っています。そこで、これを表面張力の低いヘキサンに入れます。ヘキサンを1つ、次に2つで5秒間洗い、ブロードライする準備が整います。

そこで、ウェーハを開発したばかりですが、今度はホットプレートの上に置き、ゆっくりと温度を50°Cまで上げていきます。そして、この高温により、SU8がさらに交差して構造的に剛性を高め、このホットプレートに一晩置いたままにします。したがって、14時間から20時間の間、その後、ホットプレートの電源を切り、再び室温まで冷まします。

そこで、このウェーハを小さなサイズにさいの目に切る必要があります。基本的には、このシリコンウェーハをカットして、この内側のパターンだけの小さなチップを作りたいのです。そして、エポキシを使用するこの構造のようになります。

そして、そのチップをスライドガラスに接着します。そして、これは構造的な裏付けを提供します。ですから、ウエハースをサイコロで切るのは一種の芸術ですが、できることは基本的にダイヤモンドスクライブを使用し、片方の端だけから始めることです。

そして、水晶面のために、小さな切り込みを入れるだけで、それが亀裂を生じさせ、それをこのツールでタップすることができます。これを剥がして、このような小さな構造が得られるまで、ここでさらにカットを行うことができます。そして、シリコンチップをガラスにすばやく配置して、所定の位置に取り付けます。そして、それをセットさせるのです。

そして、終わった後は、これに似たデバイスを手に入れることができます。そこで、シリコンマスターをこのスライドガラスに取り付け、次にフロイのコーティングを施すことで、後でこの構造をPDMSから解放するのに役立ちます。そこで、チップをこの乾燥剤に入れ、次にこのトライクロロサイリングの液滴を数滴取り、乾燥剤に数滴入れます。

これは、炭化水素ガスの副産物があり、かなり厳しいため、ボンネット内で行います。先に進んで蓋を閉め、これを真空に取り付けてから、これを真空から置いて、この堆積物を一晩放置して、シリコンウェーハ全体に素敵なコーティングを施します。こんにちは、ウェズリー・リーガンです。

私はChristopher Chenの研究室の大学院生です。この時点で、ネイトはED基板用のシリコーンマスターを作成する方法を示しました。ただし、このツールを使用して細胞の収縮性を測定するには、まずエラストマーシリコーンポリマーを使用して硬質な写真構造を再現する必要があります。

私たちの最初のタスクは、以前に製造したシリコーンマスターのネガティブテンプレートを生成することです。これは、PDMSまたはポリメチルスローンと呼ばれるシリコンエラストマーをPDMSポリマーに使用して行います。硬化剤を1対10の比率で追加します。

溶液を計量したら、PDMSポリマーとクロスリーク剤を十分に混合する必要があります。この混合により、明らかに多くの気泡が溶液に導入されます。したがって、この時点で、それを覆い、真空乾燥で脱気する必要があります。

PDMSが完全に脱気され、すべての気泡が表面に浮かび上がって弾けたら、真空乾燥剤からPDMSを取り除くことができます。このPDMSと架橋剤の混合物を使用して、シリコンマスターのネガティブモールドを生成できるようになりました。そしてこれを行うために、パイ缶を使用し、マウントされたシリコンマスターをその中央に配置します。

次に、DGAのポリマー溶液をシリコンウェーハの上の皿に慎重に注ぎ、追加の気泡が形成されるのを防ぎます。通常、ポリマーを約4分の1インチの厚さで注ぐように試みます。このプロセスにより、必然的に混合物にいくつかの気泡が導入されることがわかります。

そこで、この皿を約30分間置いて、泡が表面に浮かび上がって弾けるようにします。そのままにした後も、PDMSの表面にはまだいくつかの気泡があることがわかります。ただし、これらは上面にあるため、窒素をすばやくバーストして、残っている気泡をポップできます。

PDMSとCROSSLINKERソリューションを完全に架橋し、シリコンマスターの硬質ネガティブテンプレートを生成するために、摂氏110度で20分間ベークします。シリコーン基板の上にPDMSの薄い層があることがわかります。そして、2つを剥がす前に、まずこの層を切り取る必要があります。

次に、この最上層をグラフトし、シリコン基板からそっと剥がすことができます。この時点で、負のシリコン基板、つまり負のPDMS基板をシリコンマスターから離して、反転させて非常にゆっくりと剥がすことができます。さて、これは一方の端を押さえてPDMS基板をそっと剥がすことによって行います。

基板がシリコンマスターから剥がれると、前面が前進するのがわかります。シリコンマスターのA-P-D-M-Sネガティブモールドを生成したので、これを4つの個別のネガティブモールドにカットして、最終的なパッド基板を作成できます。この時点で、表面の損傷を避けるために、鉗子や手袋でネガティブ基材の上部に触れないことが重要です。

そこで、この時点で、シリコンマスターから、直径3ミクロン、深さ9ミクロンのウェルからなる4つの個別のネガティブテンプレートを生成しました。隆起したカンチレバー表面を再生するために、PDMSを使用してPDI PDMSからこれらのネガティブモールドに再度キャストできます。ただし、その前に、まずこれらのネガティブモールドをフッ素樹脂でコーティングして非粘着性にする必要があります。

これを100ワットのプラズマチャンバーでフルパワーで1分間行います。チャンバがプラズマ上でポンプダウンリターンを行うことを許可した後、これによりイオンガスフィールドが生成され、PDMSの上面がエッチングされ、フルオロCy Lane分子への接着性が高まります。真空乾燥剤からネガティブモールドを取り除いた後、ここに残っているのは、非接着性のPDMS層に3ミクロン×10ミクロンの深さのウェルが並んでいることがわかります。

mpad基板に使用する垂直カンチレバーを再生するためには、同じPDMS混合物を使用してこれから再度キャストオフする必要があり、これにより、以前に製造したシリコンマスターをまったく同じように反映するエラストマーカンチレバーの正の自立型アレイが残ります。この手順の最初のステップは、PDMSストリップとガラス顕微鏡スライドで作成した取り付け治具に、非接着性のネガティブモールドを移すことです。このリグの理由は、次のステップで明らかになります。

この時点で、私たちは、PDMSの同じ10対1の混合物の小さなドロップを架橋剤にすでに堆積させることができます 脱ガス 私たちの各ネガティブモールドの上面に。PDMSは、ネガティブモールドの端にぶつからないように、少量しか必要としません。この時点で。

PDMSを金型の上面により完全に広げるために、鉗子を使用してPDMSをつかみ、反転させ、PDMSの周りに慎重に広がる隣接する金型に接触させて、基板全体を完全に覆うことができます。このステップでは、上部のPDMS溶液にさらに気泡が入り込まないように十分注意してください。その後、他の2つのウェル、他の2つの金型で繰り返すことができます。上面全体にPDMSコーティングがより均一になったので、この治具を真空乾燥剤に入れて、ネガ型の上にPDMSフィルムに閉じ込められる可能性のある気泡をさらに除去できます。

このプロセスには通常、約 30 分かかります。ネガティブモールドの脱気中に、22 x 22 mmのガラス基板を洗浄することができ、これがパッドの最終的な取り付け場所になります。このプロセスの最初のステップは、圧縮窒素を使用してほこりの粒子を吹き飛ばすことです。

ガラスカバースリップをガスプラズマにさらすと、表面が灰になり、PMSへの接着性が高まりますので、次のステップでPMSに貼り付けます。PDMSの最上層をDGAに約30分間浸し、ガラスカバースリップをプラズマ活性化した後、テンプレートを取り外し、ガスプラズマにさらされたガラスカバースリップの上面をネガティブモールドの上のPDMS層に接触させることができます。通常、ガラスカバースリップの一方の端を最初にPDMSに接触させ、次に残りのガラスカバースリップをSHに沈殿させて、PDMSがシート状に広がるようにすると役立ちます。

これにより、PDMSフィルムに混入する気泡を抑えることができます。この時点で、鉗子でガラスカバースリップの上面をそっと押して、余分なPDMSを押し出すだけでなく、テンプレートの中央にあるPDMSクロスに対してカバースリップを微調整できます。これにより、PDMSの硬化中にカバースリップが動き回るのを防ぐことができます。

これを他の基材についても繰り返します。この時点で、テンプレート全体をオーブンに移し、摂氏110度で22時間焼くことができます。アセンブリ全体を室温まで冷ました後、基板を取り外して反転させ、ガラスカバースリップからネガティブモールドを慎重に剥がします。

ポストが押しつぶされたり、ガラス基板から引き裂かれたりしないように、これをゆっくりと均一に行うことが重要です。ネガティブモールドを剥がした後、シリコンマスターを正確に模倣したカンチレバーの配列が残っていますが、今では柔軟なPDMSエラストマーでできていることがわかります。さて、この時点で、Emad基板のSilicon Masterを生成する方法について説明しました。

その後、レプリカ成形プロセスを使用して、A-P-D-M-Sエラストマーポリマーを使用して正確なレプリカを生成し、カンチレバーが柔軟性を持ち、セルが広がり、収縮し、プロセスでカンチレバーを偏向できるようにしました。この時点で、当社の基板は細胞培養用の処理の準備が整いました。EDSを作るための金型の作り方と複製方法を見てきたので、EDSを機能させるためにさらにいくつかの手順を行い、自分自身で培養し、その後牽引力を分析できるようにします。

しかし、その前に、3つのことを行う必要があります。ポストの先端を細胞に接着させる必要があります。次に、PDMSを蛍光標識して、ポストデフレクションの視覚化と分析を支援する必要があります。

そして第三に、ポストの側壁とポストの基部をセルに非接着性にして、牽引力がポストの先端にのみ加えられるようにする必要があります。したがって、これらのステップがマイクロコンタクト印刷ベースの戦略を介してどのように進行するかについては、次の数分で見ていきます。しかし、最初に、次のステップは、余分なP-D-S-P-D-M-Sをエドからきれいにすることです。

ですから、先ほど述べたように、最初のステップはEDS基板を取ることですが、ウェストはちょうどその生成方法とトリミング方法を示しました。ガラスカバーの硬化によって生じた過剰なPDMSは、ネガティブモールドに滑り込み、鋭利なカミソリの刃のトリムを使用します。余分なPDMSは、カミソリの刃を柱の端にある基板に垂直に置き、削り取ることによってこれを行います。

また、指一本でカバースリップを固定して、カバースリップが動かないようにすることができます。したがって、最終的に得られるのは、破片が取り除かれたMパッド基板であるため、簡単にアクセスできます。したがって、次のステップでは、マイクロコンタクトを行い、MPAを印刷して、ポストの先端を接着剤でレンダリングする必要があります。

これを行うには、まずスタンプを生成する必要がありますが、このプロセスは非常に簡単です。10対1の比率ではなく、1対30の比率ではなく、PDMSを単純に混ぜます。PDMSの高さが約1cmになるようにシャーレを注ぎます。

気を抜かせてください。つまり、気泡をPDMSの上部に上昇させ、オーブンから皿を取り出して冷ました後、オーブンで60度の架橋反応を1時間硬化させ、スタンプを切り取る準備が整いました。したがって、同じ種類のカミソリの刃を使用して、ペトリ皿の底に接触するまでPDMSに垂直に押し込んでカットするだけです。

さて、スタンプの向きは私たちが注意を払いたいものです。スタンプ面は、ペトリ皿の底部に対して鋳造されたPDMSの側面になり、平らに保たれます。したがって、切り抜いたこの大きな正方形のPDMSでは、スタンプの表面が上を向いています。

さて、このスタンプはMパッドよりもはるかに大きいので、カミソリの刃でカットして再びMパッド1枚分のサイズにトリミングしますが、目でスタンプの正しい向きを見分けるのは非常に難しいので、このようにスタンプの裏側、つまり非面側になるものに少し切り込みを入れます。そして、大きなスラブからスタンプを取り外すことができます。そして、次のステップのためにA-P-D-M-Sスタンプを手に入れました。

PDMSスタンプをクリーニングしたいと思います。私がそれらを切っているときに、大気からのほこりがPDMSスタンプに付着した可能性が非常に高いためです。この結晶化皿に必要な数のPDMSスタンプを入れ、結晶化皿に100%エタノールを充填するプロセスです。

したがって、スタンプの表面を覆うのに十分なエタノールを追加するだけですが、追加されるエタノールの正確な量は重要ではありません。次に、結晶化ディスクをエターに入れ、スタンプを5分間超音波処理します。5分が経過したら、スタンプの滅菌を終了し、滅菌組織培養フードでMパッドの機能化であるマイクロコンタクト印刷の残りを行います。

それで、私たちは今、スタンプの滅菌を終えることができる組織培養フードにいます。これを行うには、結晶化皿からスタンプを取り出し、エタノールで満たされた皿に浸して残っている破片を洗い流し、最後に水の皿に浸してエタノールを洗い流します。次に、窒素の流れで、目に見える水滴がなくなるまでスタンプを乾燥させます。

そこで次のステップでは、タンパク質溶液でスタンプにインクを塗る必要があります。私たちが使用しているタンパク質溶液は、DEI水中のフィブリン1ミルあたり50マイクログラムです。タンパク質溶液の一部をピペットに取り、タンパク質溶液の滴をスタンプ面に置きます。

これを行うには、スタンプ面の端に小さな液滴を配置します。まず、使用するすべてのスタンプに対してこれを繰り返しますが、事前にこれを行う必要があります。したがって、すべてのスタンプの端にドットを配置した後の次のステップは、それらの液滴を接続し、スタンプ面にタンパク質溶液を埋めることです。

なぜかというと、液滴にタンパク質が溶液を溶かし、液滴の下にSOSが付着し、スタンプ表面が親水性になり、細胞外マトリックスタンパク質が広がりやすくなるからです。繰り返しになりますが、使用しているすべてのスタンプに対してこれを繰り返します 今、スタンプの表面にタンパク質溶液を広げると、スタンプにインクを塗る最後のステップは、端が覆われていることを確認することです。これを行うには、ピペットを傾けてスタンプ面に沿って動かし、PDMSスタンプの角とタンパク質溶液の両方に接触させるだけです。

そしてまた、インクを塗っているすべてのスタンプのすべてのエッジに対してこれを繰り返します。スタンプのインクが終わったら、スタンプをセットし、スタンプの表面にタンパク質が完全に吸収されるように、スタンプを組織培養フードに1時間放置します。さて、タンパク質が貯蔵庫に届き、スタンプの表面に吸収されるのを1時間待ったので、今度はそれらを水ですすぎ、窒素でブロードライします。

これを行うには、滅菌水を取り、スタンプの入った皿に滅菌水を注ぎます。スタンプ面に直接水を注がないように注意し、必要に応じてピペットを使用できます。あなたが持っていた水の正確な量は、水のレベルをタンパク質溶液より上に持っていく限り重要ではありません。

この後、滅菌ピンセットで、1つのスタンプを取り、それを新しい水皿に浸し、窒素で静かに吹き飛ばします。繰り返しになりますが、スタンプにタンパク質溶液の液滴が見えなくなったときに、それが乾燥していることがわかります。そして、一度に 1 つずつ処理するすべてのスタンプに対してこれを繰り返します。

スタンプを乾かしたので、次はmpad基材をUVオゾンで処理して活性化します。7分間、シャーレの蓋を上から、ディッシュの上から取り外します。なぜなら、ポリスチレンは紫外線吸収性なので、その後、皿をUVオゾン処理器に入れ、引き出しを閉じ、時間を7分間に設定して放します。

さて、今度は組織培養のフードに戻り、UVオゾンで処理したばかりのmpad基質をスタンプする時が来ました。これを行うには、すすぎ、乾燥させたスタンプを鉗子で持ち上げます。スタンプは側面で扱うことができますが、スタンプの表面には触れないでください。

鉗子のスタンプを調整して、タンパク質側にアクセスできるようにしたい。次に、タンパク質側が下を向いていることを念頭に置きながら、鉗子を反転させ、スタンプをゆっくりとedsに接触させます。1〜30個のスタンプはかなり粘着性があるため、鉗子からスタンプを解放するために2組目のピンセットを使用する必要がある場合があります。

スタンプは、約2ミリメートルから約8ミリメートルの高さからエメドに落とすことができます。次に、エメドの皿を上に傾け、鉗子で軽く押し下げて、スタンプとエドの間に接触を作ります。接触がいつ行われるかは、2つの方法のいずれかでわかります。

1つ目は、スタンプの側面からED表面を見ることです。これはカメラでは見づらいかもしれませんが、目視ではスタンプの側面から表面を見ると、スタンプが表面に接触していることがはっきりとわかります。pとの接触を確実にする2番目の方法は、蓋をした状態でペトリ皿を組織培養フードから取り出し、倒立顕微鏡で観察することです。

顕微鏡で干渉パターンを視覚化することで、スタンプがいつ、いつ、いつedsに接触しているかを知ることができるはずです。接触が決定したら、スタンプはこれと接触したままで、ED基板と数秒間接触し続けるだけで済みます。それでは、スタンプを削除する時が来ました。

これを行うには、1組のピンセットでEdsを折り、1回の滑らかな動きでスタンプをはがします。スタンプしたEdsと、以前に使用したスタンプを必ず記録してください。そして、使用したいすべての基質について、EMPAごとにこの手順を1回繰り返します。

EMPAにスタンプを付けたので、次のステップは、EMPAを滅菌し、dye eyeと呼ばれる親油性染料でインキュベートすることです。Daiは蛍光タグが付けられた親油性分子であるため、時間とともにPDMSに拡散し、顕微鏡下で偏向後を視覚化することができます。そこで、私がやろうとしていることは、個々のエンパ基質を一度に1つずつ取り、それを100%エタノール、70%エタノール、DI水、DI水、DI水、DI水に浸すことです。

そして最後に、diiのミルあたり5マイクログラムの溶液。DII溶液は蛍光性であるため、周囲光への曝露を最小限に抑え、光の退色を最小限に抑えるために、ディッシュをアルミホイルで覆い、組織培養フード内で1時間インキュベートします。EMパッドがDAI溶液中でインキュベートされるのを1時間待ったので、アルミホイルを取り外してDAI溶液を洗い流すことができます。

滅菌水に3回連続して浸漬して洗い流し、最後に0.2%オンF1 27の溶液に浸します。これは、体積あたり0.2%の重量です すべての浸漬ステップでは、EMパッドが空気にさらされる時間を最小限に抑えることが重要です。これは、ED基板の損傷を防ぎ、特に2つのポストが互いに崩壊するのを防ぐためです。

0.2%onic F1 27は、親水性ドメインと疎水性ドメインで構成されるトライブロック共重合体です。親水性ドメインはタンパク質の吸収に抵抗し、したがって細胞接着に抵抗することが知られていますが、疎水性ドメインは疎水性PDMSへのテンパーに結合します。したがって、PDMSをF1 27に浸すと、F1 27はPDMSに結合し、細胞接着をはじく。

アルミホイルで覆われたペトリ皿で慢性F1 27に1時間インキュベートした後、滅菌水、滅菌水、PBSに連続して浸漬することでF1 27を洗い流すことができます。PBSに浸漬し、製品F1 27を洗い流した後、edsの基質を選択した細胞培養溶液に浸すことができます。EMPAを浸したばかりの細胞培養液には、血清やその他の成長因子、ペニシリンやストレプトマイシンなどのサプリメントが含まれている可能性があります。

これらの成分はすべて、EMPAsのトリートメントと完全に互換性があります。さて、次のステップは、edsを細胞培養溶液に浸した後、選択した細胞をedsに播種することです。この特定の実験セットアップでは、ウシの肺大動脈内皮細胞を3つの異なる皿に播種します。

私が3つの異なるディッシュを使用している理由は、後でアッセイできるように、ポストのたわみを抑制するために、2つのディッシュを既知の触覚阻害剤で処理するためです。そこで、細胞の種をまくには、細胞懸濁液を取り、適切な量をピペットに吸い込み、各皿に滴下するだけです。十分な細胞を追加して、牽引力を測定するためのアッセイを行うときに、細胞がEDS上に単一細胞細胞として存在するようにします。

追加する量は、特定の細胞の増殖速度だけでなく、広がりの領域によって異なります。私達は通常基質のセンチメートルの二乗ごとの1500から5、000細胞の間で種をまきます。細胞の播種または細胞懸濁液の編集が終了したら、培養物を直交方向に数回ゆっくりと前後に動かして、細胞懸濁液を培養皿に混合するために、培養物に滴下します。

使用しているすべての基材に対してこのプロセスを繰り返します。細胞を播種した直後に、適切な二酸化炭素レベルの37°Cインキュベーターに細胞を置き、pHと細胞培養培地を緩衝します。細胞を播種してから約2時間後、1つの培地皿から同じ細胞培養培地の新鮮な皿に基質を移すことにより細胞をすすぐことが適切である。

このすすぎの理由は、ほとんどの細胞が広がり始め、2時間でほぼ最終的な広がり領域に到達するためです。細胞、基質をすすぐことにより、細胞培養培地から浮遊細胞を除去しています。これにより、EDSに付着し、拡散プロセスを開始している細胞のみが、牽引力のエンドポイントアッセイに現れます。

MPAで培養した細胞を用いて実施できるアッセイの1つに、細胞の収縮性のダイナミクスを定量的に調べるタイムラプスイメージングがあります。特に、可溶性因子に応答した細胞の収縮性のダイナミクスは興味深い。生物学的化合物や合成化合物などの可溶性因子は、細胞の収縮性を増加、減少、または未知の影響を与えることが知られています。

この生細胞実験では、この倒立型落射蛍光顕微鏡を使用します。顕微鏡ステージには、小さなインキュベーターボックスをサーマルレギュレーターにつないで、温度を摂氏37度、CO2を5%に維持しています。60 x planのAPO対物レンズで高倍率でイメージングします。

次に、イメージング用の衝撃基板を準備します。イメージングに使用している60倍対物レンズの作動距離は200ミクロンで、これは以前に細胞を播種した組織培養皿の厚さよりもはるかに薄いです。したがって、組織培養皿のインプラント上の細胞を画像化することはできません。

この問題を回避するために、私たちはこれらのガラス底皿を使用しています。次に、基板をガラス底皿に逆さまに移し、セルとポストの先端がガラス底皿の界面にくるようにします。したがって、これを顕微鏡に置いたとき、細胞と対物レンズの間の作動距離は200ミクロン未満になります。

これで、これを顕微鏡に載せてイメージングする準備が整いました。次に、生細胞インキュベーターチャンバーを開け、サンプルを中に入れ、インキュベーターチャンバーの蓋を元に戻します。この時点で、適切なセルのために基板をスキャンします。

イメージに。これを行う最も効率的な方法は、フェイスフェーズ1 10 x対物レンズを使用することです。これにより、基板のより広いフィールドを見ることができ、セルをより迅速に見つけることができます。私の良い細胞の基準は、単一の細胞です。

それは隣接する細胞に触れてはならず、また、基板上の他のすべての細胞と比較して平均的なサイズであるべきであり、私は見るのに適した細胞を見つけました。次に行うことは、対物レンズを60 xに切り替えて、セルを高倍率で見ることです。そのためには、対物レンズのピントをぼかし、回転中にステージをぶつけないようにします。

タレットを回転させるとチャンバーが開き、60 x 対物レンズを部分的に回転させると、60 x 60 x対物レンズが油浸レンズであるため、対物レンズに液浸油を一滴垂らす必要があります。次に、タートの回転を完了して、60 xを所定の位置に移動します。インキュベーターチャンバーを閉じ、細胞を再び焦点を合わせるために目的に再び焦点を合わせます。

セルの位置と焦点を微調整したら、CCDカメラに切り替えて、コンピューター画面でセルをプレビューしてから、タイムラプスイメージングを開始します。この実験では、位相画像と蛍光画像の両方を1分間隔で収集しますので、タイムラプスイメージングが開始され、10分または10フレーム実行し、その時点で血清を10分経過させることになります。このとき、チャンバーを開けて皿に血清を加えて細胞内の収縮性を刺激します。

タイマーはまだ動いているので、これを素早く行う必要があります さて、収縮性の変化を追跡するために、細胞のイメージングを30分間続けます。タイムラプス撮影が終了したら、画像を動画に並べて表示することができます。ここでは、位相と蛍光の画像を2つの動画で紹介します。

左側は、黒で縁取られたほぼ透明なセルの a の位相ムービーです。セルは、長方形の格子に配置された円形の構造である20本の支柱の先端に広がっています。右側は同じセルの蛍光動画ですが、ポストだけが見えています。

これらのムービーを再生すると、セルに取り付けられたポストは最初は弱く、def が偏向し、長方形の格子からほとんど逸脱していないことがわかります。映画の中盤で、メディアに美容液を追加しました。血清は細胞を刺激して収縮性を高めます。

セルが下にある支柱に大きな牽引力を加えると、セルの周囲に沿った支柱が内側に偏向し始めます。蛍光灯のムービーでは、ポストが長方形の格子内の位置から大きくずれているのがわかります。後で説明するように、これらの画像内のこれらのポスト位置の変位は、このセルの牽引力を分析するために使用できます。

これまでは、mpad基質をどのように作製し、細胞を培養するためにどのように機能化するかを見てきました。これで、完成したmpad基質を3つの異なる細胞培養皿に入れたことに気付いたでしょう。細胞は一晩で成長し続けたので、これからやろうとしていることは、個々の細胞培養皿を、既知の方法で収縮性を調節する異なる可溶性剤で処理することです。

その後、細胞を30分間固定した後に生じる牽引力を定量的に測定できます。収縮性阻害剤を添加してから30分後に可溶性因子を添加した後、細胞をパラホルムアルデヒドで固定して、牽引力の現在の状態を固定します。これを行うには、カルシウムとマグネシウムを含むパラホルムアルデヒドを使用することが重要です、そして我々は3.7%の体積パーセンテージでパラホルムアルデヒドをパラホルムアルデヒドに浸す方法は、申し訳ありませんが、これに基質を浸す方法と同じです、機能化中に異なるRINで。

つまり、基板を乾燥させないことが重要です。これは、ポスト崩壊につながる可能性があるためです。を移した後、基質を移し、パラフォームアルデヒドで20分間インキュベートします。20分が経過した後、パラフォームアルデヒドから基質を取り出し、細胞が固定されたので、これらのサンプルを標準的な免疫染色に処理できます。

これを行うには、基板を上向きにしてparamに置き、基板を覆い、PBSの下に保持するのに十分なPBSにピペットで取り付けます。次に、基質をPBSで3回すすぎ、培養物に残っている可能性のあるパラホルムアルデヒドを取り除きます。基質をPBSで3回すすいだ後、下流の免疫染色のために基質を移すことができます。

これは、ピンセットで基質を取り扱い、免疫染色の最初のステップで反転させることによって行われますが、これが浸透剤です。この場合、PBSで0.2%Triton Xを使用しています。ただし、ユーザーは、自分のニーズに最も適した任意の化エージェントを使用できます。

これをすべての基質に対して繰り返し、これが免疫染色プロセス中の基質の処理方法です。免疫染色後、基板を標準的な1インチ×3インチのスライドガラスに取り付け、倒立型または直立型の任意のエピ蛍光顕微鏡で処理できます。共焦点顕微鏡でサンプルを処理することにより、ポストの底部に焦点を合わせて、ヌル位置である偏向なしを取得できます。

次に、ポストの先端まで焦点を合わせ、ポストの別の画像をスナップし、上部と下部の画像を比較することで、ポストのたわみを測定し、セルの牽引力を計算できます。そのセルは、そのようなたわみを生成するために生成します。このプロセスをいくつかの異なる条件の多くの異なるセルに対して行うことにより、異なる条件で生成される牽引力を比較できます。生細胞と固定細胞の両方の画像が収集されたので、次のタスクはたわみを測定し、細胞内の牽引力を測定することです。

これを行うために、これを行うために、私たちはmatlabでコンピュータープログラムを作成しました。これらは、この分析で使用する 3 つの画像です。前記第1の画像は、細胞の位相像である。

これは、セルの位置を特定するのに役立ちます。2 番目の画像は、ポストの上部の蛍光画像です。この画像を使用して、の先端にあるポストの位置を特定します。

ご覧のとおり、これらのポストの一部は、このポストのように、ほとんどのポストが配置されている長方形の格子から偏向し、逸脱しています。そして、この投稿。3 番目の画像はベース画像で、a の a、at 、のベースを横切る焦点面でのポストの位置をキャプチャします。

このレベルでは、偏向したポストと偏向していないポストの両方を、静止位置、つまり un、un deflected の位置に配置する必要があります。長方形の格子では、2 番目の画像で偏向したポストが基部で FL 位置にあることがわかります。この画像は、投稿の位置を見つけるために使用されます、それは、それが反映された位置の下にあります。

次に、MATLABプログラムをロードすると、これら3つの画像をロードするように求められます。ファイルに名前を付けます。位相イメージが表示されます。

セルがどこにあるかを示すボックスを周囲に描画して、プログラムが分析する投稿を認識できるようにします。次に、プログラムは、トリミングされた画像の強度、しきい値処理、および化を実行して、投稿のOID座標を決定します。左側は上部の画像から投稿の画像化され、右側はベース画像から同じ投稿の画像化されています。

ポストを取得した後、OID座標は、プログラムは、その後、各ポストの先端と基部との間の変位ベクトルを決定することができます。これらのポストディスプレイスメントベクトルは、ポストのスプリング定数を掛けることにより、フォースベクトルに変換できます。これらの細胞力は、細胞あたりの平均力やポストあたりの平均力など、さまざまな方法で分析できます。

有用な結果の1つは、力の空間分布を視覚化できる矢筒プロットです。これは先ほど分析したセルで、力の大きさと力の方向を指し示すポストに黄色の矢印を重ねていることがわかります。タイムラプスムービーで必要な画像などのシーケンス画像に対してこの画像分析プロセスを繰り返すことで、時間的なシーケンスを生成できます。

こちらは、血清で刺激した細胞の様子を動画でご紹介します。ご覧の通り、血清を添加した瞬間、細胞の収縮性が増し、ポストがさらに偏向しました。さらに、異なる条件にさらされ、その後固定染色された細胞の数が多い場合の力を定量化できます。これは、コントロール化合物で処理された細胞と収縮性阻害剤で処理された細胞を示すこれらの矢筒プロットで例示されます。

できる限り。ご覧のとおり、コントロール ケースのセル上の 、 上の力ベクトルは、力ベクトルよりも長さが大きい方よりも大きくなっています。収縮性阻害剤が使用された2つのケースでは、ここでは、微細加工からサンプル調製、実験、分析までのパス基板を説明するために、多くの材料材料を取り上げ、これらの基板の多様な汎用性を実証しました。

ライブセルイメージングと固定サンプルアッセイの2つの異なるアッセイについて説明し、これらのアッセイの両方から得られた細胞の解析を行い、クイバープロットとクイバームービーを示しました。この強力なツールを使用すると、細胞の収縮性についてさまざまな空間的および時間的分析を行うことができます。ご覧の通り、この手法は、マイクロファブリケーション、基礎細胞生物学、表面科学、画像解析・処理など、さまざまな分野から利用されています。

また、その方法がいくつかの異なるエンジニアリング技術に基づいているからこそ、ポストジオメトリ、誘導される可溶性因子、ポストのたわみを分析する方法などのパラメータは、ユーザーのニーズに応じてカスタマイズできます。過去20分、30分で概説したこの方法の視覚的なデモンストレーションが、制御、機能的結果、および細胞引力の生成に関する他のより深い分析の出発点として使用できることを願っています。