微細加工後のアレイ検出器（mPADs）：機械的な力を単離するためのアプローチ

こんにちは、Nathan Snia Deckyです。本日はWes Ligan、Robbie Desai、Mike Yangと共に、ペンシルベニア大学のChris Chenの研究室からお伝えします。このビデオでは、微細加工されたポストアレイを用いて細胞の牽引力を測定する手法について解説します。

牽引力はミオシンとアクチンの相互作用を通じて生成され、我々の生理機能において重要な役割を果たします。発生過程において、牽引力は細胞が組織の初期構造を形成するためにある場所から別の場所へと移動することを可能にします。また、傷口の閉鎖や、体中における白血球の遊走や匍匐（ほふく）移動に不可欠であるため、治癒プロセスにも寄与しています。

しかし残念ながら、がんの転移や腫瘍への血管新生の場合、これらの同一の力が健康に悪影響を及ぼすことがあります。そのため、これらの牽引力を定量的に、特に個々の細胞のマイクロおよびナノスケールで実際に測定できる手法はごくわずかです。in vitro で細胞を研究するための一般的な手法の多くは、ガラス底ディッシュやポリスチレン製ディッシュを用いてきましたが、これらは非常に剛性の高い基質であるため、細胞が引き起こす牽引力や変形を物理的に測定することはできません。

そのため、何らかの物理的な読み出し手段がなければ、牽引力の根底にあるメカニズムを理解することは非常に困難でした。そこで、Chris Chenの研究室では、これらの制限を克服するための技術を開発しました。我々の手法は、柔軟なカンチレバーの垂直アレイに基づいています。このカンチレバーの剛性とサイズスケールは、個々の細胞が複数のカンチレバーにわたって広がり、その過程でカンチレバーをたわませるように設計されています。

最も頻繁に使用する寸法は、直径 3 µm、高さ 10 µm の円筒形ポストであり、中心間距離 9 µm の矩形アレイ状に配置されています。ただし、これらの寸法は、さまざまな細胞研究に合わせて変更することが可能です。まず、こちらにある硬いシリコンマスターから作成し、それをこちらに見える柔軟な PDMS カンチレバーへと転写します。

この手法を用いることで、顕微鏡下で個々のカンチレバーのたわみを測定し、そのようなたわみを発生させるのに必要な大きさおよび方向を持つ細胞牽引力を算出することができます。我々はこれらの基板を、マイクロポストアレイ検出器であるM padとして開発しました。このビデオでは、シリコンマスターの作製からPDMSによる複製、そして最終的な変調および細胞収縮性の計算に至るまで、M padの作製方法について解説します。それでは、ラボのクリーンルームからお伝えします。

ここは、シリコンマスターとなるSU-8ポストを作製するための、防塵および遮光設備が整った部屋です。まず、シリコンウェーハを用意し、そこにSU-8フォトレジストを塗布します。SU-8はネガ型のレジストであり、光感受性を有しています。そのため、フォトマスクを通して光を照射すると、光によってマイクロポストがパターニングされ、3次元構造が形成されます。こうしてできたSU-8ポストを型として、PDMSでキャスティングを行います。

すべての処理を終えた後、ウェハはこのようになります。ここには、すでにウェハ上に作製されたマイクロピラーおよびマイクロポスト構造があります。マスターを作製するために、まずベアシリコンウェハを用意し、これをオゾン処理で7分間洗浄し、さらに120 °Cで30分間脱水処理を行いました。ここにSU-8 2002をスピンコートし、ポスト用の非常に薄いベース層を形成します。

SU-8をスピンコートするため、ガスマスクを着用します。ウェハをこちらのホルダーにセットし、付着しているほこりを払い落とします。それをスピンコーターに置き、中心に合わせているかを確認します。その後、SU-8 2002をその上に滴下します。そして、ウェハを回転させます。その後、ソフトベークのためにホットプレートに置きます。

その後、1分間この操作を行います。次に、それを95°Cに設定したホットプレートに移し、2分間加熱します。

完了しましたら、これをマスクアライナーへ移してフロッド露光を行います。さて、ウェハ上のSU-8の第1層のスピンコートが完了しましたので、次はウェハ全体にフロッド露光を行い、マイクロポストの第1ベース層を作成する必要があります。そのため、70 mJの露光量を照射します。

そこで、このマスクアライナーにおける実際の光強度を測定する必要があります。メーターをマスクアライナーにセットし、光を照射します。

こちらはUVライトです。シリコンウェハをマスクアライナーにセットし、内部に配置します。今回はマスクを使用せず、フィルム全体に露光させます。

シャッターを閉じ、露光時間を1分に設定して露光を開始します。1分後、システムの処理が完了したら、ウェハを取り出します。次に、露光後ベーク（PEB）を行います。

ウェハの露光が完了しましたので、ここから熱を加えて、1層目のSU-8コーティングの架橋反応を促進させます。まず、65 °Cのホットプレートに1分間置き、次に95 °Cのホットプレートに移して2分間加熱します。2分間の処理後、ホットプレートの電源を切り、ウェハを室温まで冷却させます。これには約30分かかります。

ウェハーにSU-8の2層目をスピンコートしました。次に、フォトマスクを用いて露光を行います。今回は、深紫外線を遮断するためにUVフィルターを使用します。

これは入手可能なHOYA製光学ガラスですが、今回は再度強度を測定する必要があります。そのため、光度計を使用するか、上部のフィルターを用いて濾過された強度を測定します。その後、マスクアライナーにマスクをロードします。

このスイッチで真空を作り、マスクを固定します。次に、それをマスクアライナーにセットします。続いてフィルターを上に置き、ウェハーをロードします。

良好な密着性を確保するため、ウェハーを上げて密着させ、その後露光を開始します。露光後、マスクアライナーからウェハーを取り出します。これにより、選択的に露光された領域が形成されます。このウェハーをオーブンまたはホットプレートに移し、露光後ベーク（PEB）を行います。

最終ポストエクスポージャーベイク（PEB）が完了しましたので、ここからウェハーを現像し、三次元構造を形成します。PGMEAで洗浄および現像を行うことで、未露光のSU-8を除去します。まず、PGMEAを満たした容器にウェハーを入れ、緩やかに攪拌しながら2分間静置します。

そのまま2分間放置します。その後、2枚目のPGMEAが入ったディッシュに移します。これにより、SU-8を含んで飽和したPGMEAを取り除くことができます。

10秒後、IPAに浸します。これによりPGMEAが洗い流されます。ここに20秒間浸し、再び軽く攪拌します。

そして、現在は自立したポスト構造が得られています。そこで、表面張力の低いヘキサンに浸します。1回目と2回目のヘキサンでそれぞれ5秒間洗浄し、その後、エアドライ（吹き付け乾燥）を行う準備が整います。

ウェハの開発が完了しましたので、これをホットプレートに載せ、温度を150°Cまでゆっくりと上昇させます。これにより、高温状態でSU-8がさらに架橋され、構造的な剛性が高まります。このホットプレートに一晩、およそ14時間から20時間置いておきます。その後、ホットプレートの電源を切り、再び室温まで冷却させます。

したがって、このウェハーをより小さいサイズにダイシングする必要があります。基本的には、このシリコンウェハーをカットし、ここにある内部パターンのみの小さなチップを作成します。そして、エポキシを使用する次のような構造になります。

このように、チップをガラススライドに接着します。これにより、構造的な支持が得られます。ウェハーのダイシングはある種の技術を要しますが、基本的にはダイヤモンドスクライバーを使用し、端の一箇所から切り始めます。

結晶面に沿っているため、小さな切り込みを入れます。これで亀裂が生じたので、このツールで叩きます。これを剥がし、このような小さな構造になるまでさらに切断を繰り返します。その後、シリコンチップを素早くガラス上に配置し、固定します。そして、それが定着するまで待ちます。

そして完了後には、このようなデバイスが出来上がります。シリコンマスターをこのガラススライドに固定しました。次に、後でPDMSからこの構造体を剥離しやすくするために、フルオロスランのコーティングを施します。チップをこのデシケーターに入れ、トリクロロシランを数滴、デシケーターの中に滴下します。

この操作はフード内で行います。なぜなら、副産物として刺激の強い塩化水素ガスが発生するためです。蓋を閉め、真空ポンプに接続します。そして真空状態で一晩放置し、シリコンウェーファー全体に均一なコーティングを形成させます。ウェスリー・リガンです。

私はChristopher Chenの研究室の大学院生です。これまでに、NateがED基板用のシリコンマスターの作成方法を説明しました。しかし、このツールを用いて細胞の収縮性を測定する前に、エラストマーシリコンポリマーを使用して、硬いフォト構造を複製する必要があります。

最初のタスクは、先に作成したシリコンマスターのネガ型を作成することです。これには、PDMS（ポリジメチルシロキサン）と呼ばれるシリコンエラストマーを使用します。PDMSポリマーに、10:1の比率で硬化剤を加えます。

溶液の計量が完了したら、PDMSポリマーと架橋剤を十分に混合させる必要があります。この混合プロセスによって、溶液中に多くの気泡が混入します。そのため、ここで溶液を密閉容器から出し、真空デシケーター内で脱気させる必要があります。

PDMSの脱気が完全に完了し、すべての気泡が表面に上昇して消えたら、真空デシケーターから取り出します。このPDMSと架橋剤の混合物を使用して、シリコンマスターのネガティブモールドを作成します。そのために、パイ皿を用意し、そこに固定したシリコンマスターを中央に配置します。

次に、追加の気泡が発生しないように注意しながら、シリコンウェハーの上にDGAsポリマー溶液を慎重にディッシュに注ぎます。通常、ポリマーの厚さは約0.25インチになるように注ぎます。この過程で、混合物の中に不可避的にいくつかの気泡が混入することがわかります。

次に、気泡が表面に上昇して消えるまで、このディッシュを約 30 分間静置します。静置後、PDMS の表面にまだいくつかの気泡が残っていることがわかります。しかし、これらは最表面にあるため、窒素ガスを短時間吹き付けることで、残りの気泡を消去することができます。

PDMSと架橋剤（CROSSLINKER）溶液を完全に架橋させ、シリコンマスターの剛性のあるネガティブテンプレートを作成するために、110 °Cで20分間加熱します。シリコン基材の上に薄いPDMS層があることが確認できます。これら2つを剥がす前に、まずこの層を切り出す必要があります。

次に、この最上層をグラフトし、シリコン基板からゆっくりと剥離させます。この時点で、シリコン基板のネガ、つまりPDMS基板のネガを反転させ、シリコンマスターから非常にゆっくりと剥がすことができます。具体的には、端の一方を押さえたまま、PDMS基板をそっと剥がしていきます。

基材がシリコンマスターから剥がれるにつれて、前線が進むのがわかります。シリコンマスターのPDMSネガティブモールドを作成したので、これを4つの個別のネガティブモールドに切断し、最終的なパッド基材を作製します。この際、表面への損傷を避けるため、ピンセットや手袋でネガティブ基材の上面に触れないようにすることが重要です。

ここまでの手順で、直径3 µm、深さ9 µmのウェルを持つシリコンマスターから、4つの個別のネガティブテンプレートを作成しました。隆起したカンチレバー表面を再現するために、PDMSを用いてこれらのネガティブモールドに再度キャストします。ただし、その前に、フルオロスライディング剤でコーティングし、これらのネガティブモールドを非粘着性にすることが必要です。

これを100Wのプラズマチャンバーを用い、フルパワーで1分間行います。チャンバー内を排気した後、再びプラズマを印加します。これによりイオンガス場が生成され、PDMSの表面がエッチングされ、フルオロCy Lane分子に対する接着性が向上します。真空デシケーターからネガ型を取り出すと、非接着性のPDMS層に深さ3 µm × 10 µmのウェルアレイが形成されていることが確認できます。

mpad基板に使用する垂直カンチレバーを再生するためには、同様のPDMS混合物を用いて再度キャストし、先に作製したシリコンマスターを正確に反映した、自立型のエラストマーカンチレバーのポジティブアレイを作成する必要があります。この手順の最初のステップは、非粘着性のネガティブモールドを、PDMSストリップとガラス製顕微鏡スライドで作成したマウント用ジグに転写することです。この器具を使用する理由は、次のステップで明確になります。

ここで、あらかじめ脱気しておいたPDMSと架橋剤の10:1混合液を、各ネガティブモールドの上面に少量滴下します。PDMSがネガティブモールドの端まで流れ出さないよう、少量を滴下してください。

PDMSをモールドの上面にさらに均一に広げるため、ピンセットで1つのモールドをつかんで反転させ、隣接するモールドに接触させます。その後、PDMSを慎重に広げ、基板全体を完全に覆います。このステップでは、PDMS溶液にさらなる気泡が混入しないよう十分注意してください。同様の操作を他の2つのウェル（モールド）に対しても繰り返します。上面にPDMSがより均一にコーティングされた状態で、このジグを真空デシケーターに入れ、ネガティブモールド上のPDMSフィルム内に閉じ込められている可能性のある気泡をさらに除去します。

この工程には通常、約30分かかります。ネガ型を脱泡させている間に、パッドの最終的な固定場所となる22 by 22 millimeterのガラス基板を洗浄します。この工程の最初のステップは、圧縮窒素を用いて塵埃を吹き飛ばして除去することです。

ガラスカバーガラスをガスプラズマに曝露させます。これにより表面がアッシングされ、次のステップで貼り付けるPMSへの接着性が向上します。PDMSの最上層を約30分間DGAにさらし、ガラスカバーガラスをプラズマ処理した後、テンプレートを取り除き、ガスプラズマに曝露させたガラスカバーガラスの上面を、ネガ型上のPDMS層に接触させます。通常、まずガラスカバーガラスの一端をPDMSに接触させ、その後、残りの部分をゆっくりと定着させることで、PDMSがシート状に広がるようにすると効果的です。

これにより、PDMSフィルムに混入した気泡を減らすことができます。ここで、ピンセットでガラスカバースリップの上面を軽く押し、余分なPDMSを押し出すとともに、カバースリップをテンプレート中央のPDMSクロスに密着させます。これにより、PDMSの硬化中にカバースリップが移動するのを防ぐことができます。

他の基板についても同様の操作を繰り返します。この時点で、テンプレート全体をオーブンに移し、110 °Cで22時間焼成します。アセンブリ全体を室温まで冷却した後、基板を取り出して反転させ、ガラスカバースリップからネガ型モールドを注意深く剥がします。

ポストを押し潰したり、ガラス基板から剥がしたりすることを避けるため、ゆっくりと均一に行うことが重要です。ネガ型のモールドを剥がすと、シリコンマスターを正確に模したカンチレバーの配列が残っていることがわかります。ただし、これらは柔軟なPDMSエラストマーで構成されています。これで、EMAD基板のシリコンマスターをどのように作製するかという手順の説明が完了しました。

次に、A-P-D-M-Sエラストマーポリマーを用いたレプリカ成形プロセスにより、正確な複製を作成しました。これにより、カンチレバーに柔軟性が備わり、細胞が伸展・収縮する際にカンチレバーをたわませることが可能になります。これで、基板は細胞培養の処理に使用できる状態になりました。EDSを製作するためのモールドの作製と複製方法を確認しましたので、ここからは、細胞を培養し、その後に牽引力を解析できるように、EDSを機能させるための追加ステップに進みます。

しかし、その前に3つの手順を行う必要があります。まず、ポストの先端を細胞に対して接着性にする必要があります。次に、ポストのたわみを可視化および解析しやすくするため、PDMSを蛍光ラベル化する必要があります。

そして3点目に、牽引力がポストの先端のみに及ぶようにするため、ポストの側壁および底面を細胞に接着しないように処理する必要があります。これらの一連のステップを、マイクロコンタクトプリンティングに基づいた手法でどのように進めるかを、この後の時間で説明します。しかしその前に、次のステップとして、エッジから余分なPDMSを除去します。

前述したように、最初のステップはEDS基板を準備することです。ウェストが、ネガティブモールドに対してガラスカバースリップを硬化させた際に生じた余分なPDMSを、鋭いカミソリで切り揃える方法を説明しました。この余分なPDMSの除去は、カミソリをピラーのエッジに沿って基板に対して垂直に当て、削り取ることで行います。

カバーガラスが動かないように、指一本で押さえて固定します。これで、ゴミが除去され、アクセスしやすい状態のMパッド基板が完成しました。次のステップでは、ポストの先端を接着性にするために、MPAをマイクロコンタクトプリントします。

これを行うために、まずスタンプを作製する必要があります。この工程は非常に簡単です。PDMSを通常（10:1）ではなく、1:30の比率で混合します。そして、PDMSの高さが約1 cmになるようにペトリ皿に流し込みます。

脱気させます。つまり、PDMS内の気泡が表面に上昇するまで待ちます。その後、オーブンで60°Cで1時間加熱し、架橋反応を進行させます。オーブンから取り出して冷却した後、スタンプを切り出す準備が整います。ここでも同様のカッターナイフを使用し、ペトリ皿の底に到達するまで、PDMSを垂直に押し切ってください。

次に、スタンプの向きに注意する必要があります。スタンプ表面は、平坦さを維持するためにペトリ皿の底に合わせてキャストしたPDMSの面になります。したがって、切り出したこの大きな正方形のPDMSでは、現在はスタンプ表面が上を向いています。

このスタンプはMパッドよりもかなり大きいため、カミソリでカットして、再びシングルMパッドのサイズまで切り詰めます。スタンプの正しい向きを目視で判断するのは非常に困難であるため、このように、スタンプの背面（非フェイス面）となる部分に小さな切り込みを入れます。これで、スタンプを大きなスラブから取り出すことができます。これで、次のステップに使用するA-P-D-M-Sスタンプが用意できました。

PDMSスタンプを洗浄します。スタンプの切り出し時に、大気中のホコリが付着した可能性があるためです。この工程では、必要な数のPDMSスタンプをこの結晶化皿に入れ、100%エタノールを皿に満たします。

スタンプの表面が浸る十分な量のエタノールを加えますが、エタノールを添加する正確な量は重要ではありません。次に、結晶化ディスクをBeker（ビーカー）に入れ、スタンプを5分間超音波処理します。5分後、スタンプの滅菌処理は完了となります。その後、無菌的な組織培養フード内で、Mパッドの機能化というマイクロコンタクトプリントの残りの工程を行います。

それでは、スタンプの滅菌処理を完了させるため、組織培養フードに移動します。まず、結晶化用ディッシュからスタンプを取り出し、エタノールを満たしたディッシュに浸して残った破片を洗い流します。最後に、水が入ったディッシュに浸してエタノールを洗い流します。その後、窒素気流を用いて、目に見える液滴がなくなるまでスタンプを乾燥させます。

次のステップでは、タンパク質溶液を用いてスタンプにインクを付けます。使用するタンパク質溶液は、DEI水に溶解した 50 µg/mL のフィブリンです。ピペットでタンパク質溶液を吸い取り、スタンプの面に滴下します。

スタンプ面の端に小さな液滴を配置することで、この操作を行います。まず、使用するすべてのスタンプに対してこの操作を繰り返してください。これは事前に行っておくべき工程です。すべてのスタンプの端に液滴を配置した後の次のステップは、それらの液滴を繋げ、スタンプ面全体にタンパク質溶液を満たすことです。

これを行う理由は、液滴内のタンパク質溶液が液滴の下にあるSOSに浸透し、スタンプ表面を親水性にすることで、細胞外マトリックスタンパク質を広げやすくするためです。したがって、使用するすべてのスタンプに対してこの操作を繰り返してください。スタンプの表面にタンパク質溶液を広げたので、インキングの最終ステップは、エッジ部分が確実にカバーされているかを確認することです。これを行うには、ピペットを斜めに傾け、PDMSスタンプのコーナーとタンパク質溶液の両方に接触するように、スタンプ表面に沿って動かします。

同様の手順を、インクを塗布するすべてのスタンプのすべてのエッジに対して繰り返します。スタンプへのインク塗布が完了したら、タンパク質がスタンプ表面に完全に吸収されるまで、組織培養用フード内に1時間放置します。タンパク質がスタンプ表面に吸収されるまで1時間待機した後、水で洗浄し、窒素ガスでブロードライさせます。

この操作を行うには、滅菌水を用意し、スタンプが入ったディッシュに注ぎます。この際、スタンプの表面に直接水をかけないように注意してください。必要に応じてピペットを使用しても構いません。水面の高さがタンパク質溶液を超えていれば、正確な水量にこだわる必要はありません。

その後、滅菌ピンセットでスタンプを1つ取り出し、新しい水が入ったディッシュに浸し、窒素でそっと吹き付けて乾燥させます。スタンプ上にタンパク質溶液の液滴が見えなくなれば、乾燥したことになります。処理するすべてのスタンプについて、この操作を1つずつ繰り返します。

スタンプをすすいで乾燥させたので、次はUVオゾン処理によりmpad基材を活性化させます。ポリスチレンはUVを吸収するため、ペトリ皿の蓋を取り外します。その後、皿をUVオゾン処理装置に入れ、ドロワーを閉め、時間を7分に設定して処理を開始します。

それでは、再び組織培養用クリーンベンチに戻り、UVオゾン処理を終えたばかりのmpad基板にスタンプを押印します。まず、洗浄・乾燥させたスタンプをピンセットで持ち上げます。スタンプは側面を持って操作し、印面には触れないようにしてください。

ピンセット内のスタンプを調整し、タンパク質側がアクセス可能な状態にします。次に、タンパク質側を下に向けてピンセットを反転させ、ゆっくりとスタンプをedsに接触させます。1番から30番までのスタンプはかなり粘着性が強いため、ピンセットからスタンプを離すために2本目のピンセットを使用する必要がある場合があります。

スタンプを約2mmから8mmの高さからemeds上に落とします。次に、emedsのディッシュを傾け、ピンセットで軽く押し下げて、スタンプとedsを接触させます。接触したかどうかは、次の2つの方法のいずれかで判断できます。

1つ目の方法は、スタンプの側面からED表面を確認することです。これはカメラ越しでは見えにくいかもしれませんが、肉眼でスタンプの側面から表面を見ることで、スタンプが表面に接触していることがはっきりと確認できます。接触を確認する2つ目の方法は、蓋をした状態でペトリ皿を組織培養フードから出し、倒立顕微鏡下で観察することです。

顕微鏡で干渉縞を可視化することで、スタンプがEDS基板に接触したタイミング、および実際に接触しているかどうかを判断できます。接触が確認できたら、スタンプをEDS基板に数秒間接触させた状態で保持します。その後、スタンプを取り除きます。

この操作を行うには、ピンセット1本で端を折り曲げ、一度のスムーズな動作でスタンプを剥がします。どの端にスタンプを押したか、およびどのスタンプを既に使用したかを必ず記録しておいてください。そして、使用したいすべての基板に対し、EMPAにつき1回ずつこの手順を繰り返します。

EMPAのスタンプが完了しましたので、次のステップでは、これらを滅菌し、「dye eye」と呼ばれる親油性染料でインキュベートします。Dye eyeは蛍光標識された親油性分子であるため、一定時間かけてPDMS内に拡散し、顕微鏡下でポストのたわみを可視化することが可能になります。そこで、個々のEMPA基板を一つずつ取り出し、100%エタノール、70%エタノール、そして超純水（DI water）に順次浸します。

最後に、5 µg/mLのDiI溶液を用意します。DiI溶液は蛍光性であるため、周囲の光への露出を抑え、光退色を最小限にするために、組織培養フード内で1時間インキュベートする間、ディッシュをアルミホイルで覆います。EMパッドをDiI溶液中で1時間インキュベートしたところで、アルミホイルを取り除き、DiI溶液を洗い流します。

滅菌水に3回連続して浸漬させることで洗浄し、最後に0.2%onic F1 27溶液（w/v）に浸漬させます。すべての浸漬ステップにおいて、EMパッドが空気にさらされる時間を最小限に抑えることが重要です。これは、ED基板への損傷を防ぎ、特に2つのポストが互いに崩壊して接触することを防ぐためです。

0.2%のPluronic F127は、親水性ドメインと疎水性ドメインで構成されるトリブロック共重合体です。親水性ドメインはタンパク質の吸着を抑制し、その結果として細胞接着を阻害することが知られており、一方で疎水性ドメインは疎水性のPDMSに結合します。したがって、PDMSをF127に浸漬させると、F127がPDMSに結合し、細胞接着を排除します。

アルミホイルで覆ったペトリ皿の中でchronic F1 27に1時間インキュベートした後、滅菌水、滅菌水、そしてPBSに順次浸漬させることでF1 27を洗い流します。PBSへの浸漬により製品F1 27が洗い流された後、基板edsを任意の細胞培養液に浸漬させることができます。ここでEMPAsを浸漬させた細胞培養液には、血清やその他の成長因子、およびペニシリンやストレプトマイシンなどのサプリメントが含まれている場合があります。

これらの成分はすべてEMPAs処理と完全に互換性があります。次に、電解紡績（eds）を細胞培養液に浸漬させた後、選択した細胞をedsに播種します。今回の特定の実験セットアップでは、ウシ肺動脈内皮細胞を3つの異なるディッシュに播種します。

3種類の異なるディッシュを使用する理由は、2つのディッシュに既知の触覚阻害剤を処理し、後に解析を行う際にポストのたわみを抑制させるためです。細胞を播種するために、細胞懸濁液から適切な量をピペットで吸い上げ、各ディッシュに滴下します。牽引力を測定するアッセイを行う際に、細胞がEDS上で単一細胞として存在するように、十分な量の細胞を添加します。

添加する量は、播種面積および使用する細胞の増殖速度によって異なります。通常、基質の1 cm²あたり1,500から5,000個の細胞を播種します。細胞の播種または細胞懸濁液の滴下を完了した後、培養皿を前後および左右の直交方向に数回そっと揺らし、細胞懸濁液を培養皿内で混合させます。

使用するすべての基質に対してこの操作を繰り返します。細胞を播種した後、直ちにpHおよび細胞培養液を緩衝するために、適切な二酸化炭素濃度に設定した37 °Cのインキュベーターに入れます。播種から約2時間後、基質を一度培地に入れたディッシュから、同じ細胞培養液を入れた新しいディッシュに移すことで、細胞を洗浄します。

この洗浄を行う理由は、ほとんどの細胞が2時間までには拡がりに始まり、ほぼ最終的な拡がり面積に達しているためです。細胞および基質を洗浄することで、細胞培養液中に浮遊している細胞を除去できます。これにより、EDSに付着し、拡がりプロセスを開始した細胞のみを、牽引力のエンドポイントアッセイで検出することが可能になります。

MPA上で培養した細胞を用いて実施可能なアッセイの一つに、細胞収縮性のダイナミクスを定量的に解析するタイムラプスイメージングがあります。特に、可溶性因子に応答した細胞収縮性のダイナミクスは非常に興味深い現象です。生物学的化合物や合成化合物などの可溶性因子は、細胞収縮性を亢進させたり、減退させたり、あるいは未知の影響を及ぼすことが知られています。

このライブセル実験では、この倒立エピ蛍光顕微鏡を使用します。顕微鏡ステージ上には、温度を37 °C、5 % CO2に維持するために温度調節器に接続された小型インキュベーターボックスを設置しています。60 x Plan APO対物レンズを用いて、高倍率でイメージングを行います。

それでは、イメージング用のインパクト基板を準備します。イメージングに使用する60倍対物レンズの作動距離は200 µmであり、これは先に細胞を播種した組織培養皿の厚さよりもはるかに短いため、組織培養皿上のインプラント上の細胞をイメージングすることはできません。

この問題を解決するために、これらのガラスボトムディッシュを使用します。次に、細胞とポストの先端がガラスボトムディッシュの界面に接するように、基材を逆さまにしてガラスボトムディッシュに移します。これにより、顕微鏡に設置した際、細胞と対物レンズの間の作動距離が200 microns未満になります。

これで、イメージングのために顕微鏡に設置する準備が整いました。次に、ライブセルインキュベーターチャンバーを開け、サンプルを中に入れ、インキュベーターチャンバーの蓋を閉じます。この時点で、基材をスキャンして適切な細胞を探します。

イメージングを行うには、10倍の位相差対物レンズを使用するのが最も効率的です。これにより、基質のより広い視野を観察でき、細胞をより迅速に見つけることができます。適切な細胞の選択基準は、単一の細胞であることです。

周囲の細胞に接触しておらず、基質上の他のすべての細胞と比較して大きさが平均的なものであることを確認し、観察に適した細胞を選定しました。次に、対物レンズを60 xに切り替えて、細胞を高倍率で観察します。その際、回転時にステージにぶつからないよう、対物レンズのピントをずらしておきます。

ターレットを回転させる際にチャンバーを開き、60x対物レンズを部分的に回転させます。60x対物レンズは油浸レンズであるため、対物レンズ上に浸漬油を1滴滴下する必要があります。ここでターレットの回転を完了させ、60xレンズを所定の位置に合わせます。インキュベーターチャンバーを閉じ、対物レンズの焦点を再調整して細胞にピントを合わせます。

細胞の位置とフォーカスを微調整した後、CCDカメラに切り替えてコンピュータ画面上で細胞を確認し、タイムラプスイメージングを開始します。この実験では、1分間隔で位相差像と蛍光像の両方を収集します。タイムラプスイメージングを開始し、10分間（または10フレーム）経過させます。その時点で血清を添加します。10分が経過しました。ここでチャンバーを開き、細胞の収縮性を刺激するためにディッシュに血清を添加します。

タイマーがまだ作動しているため、急いで作業を行う必要があります。次に、収縮性の変化を追跡するため、さらに30分間、細胞のイメージングを継続します。タイムラプスイメージングが完了した後、画像をつなぎ合わせて、ここに示すような動画を作成できます。以下は、位相差画像と蛍光画像の2つの動画です。

左側は、黒い輪郭線で囲まれたほぼ透明な細胞の位相差顕微鏡動画です。細胞は、長方形の格子状に配置された円形の構造体である20本のポストの先端に広がっています。右側は同じ細胞の蛍光顕微鏡動画ですが、ポストのみが見えています。

これらの動画を再生すると、細胞に付着しているポストが最初は弱く、たわみが小さく、矩形格子からほとんど逸脱していないことがわかります。動画の中盤で、培地に血清を添加しました。血清は細胞を刺激し、収縮性を高めます。

細胞が下層のポストに対してより大きな牽引力を及ぼすと、細胞の周囲にあるポストが内側にたわみ始めます。蛍光動画では、ポストが矩形格子上の位置から大きく逸脱していく様子が確認できます。後述するように、これらの画像におけるポスト位置の変位を利用して、この細胞の牽引力を解析することが可能です。

これまでに、mpad基板の作製方法と、細胞を培養するための機能化の方法について説明しました。完成したmpad基板を3つの異なる細胞培養ディッシュに入れたことに気づかれたかと思います。細胞を一晩培養させましたので、ここからは、それぞれの細胞培養ディッシュに、収縮性を既知の方法で調節する異なる可溶性薬剤を添加します。

これにより、細胞を固定した後の牽引力を定量的に測定することができます。収縮抑制剤を添加して30分後、可溶性因子を添加してさらに30分後となりましたので、現在の牽引力の状態を固定するために、パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。この際、カルシウムとマグネシウムを含むパラホルムアルデヒドを使用することが重要であり、ここでは体積パーセント濃度 3.7% のパラホルムアルデヒドを使用します。基質をパラホルムアルデヒドに浸漬させる方法は、機能化の際に異なるRINに基質を浸漬させた方法と同様です。

つまり、基質を乾燥させないことが重要です。乾燥するとポストコラップス（構造崩壊）を引き起こす可能性があるためです。基質を転送した後、パラホルムアルデヒド中で20分間インキュベートします。20分が経過したら、基質をパラホルムアルデヒドから取り出します。細胞が固定されたので、これらのサンプルを標準的な免疫染色に供することができます。

そのため、基板をパラフォームアルデヒド上で上向きに配置し、基板が完全に浸かる十分な量のPBSをピペットで滴下します。次に、培養液に残っている可能性のあるパラフォームアルデヒドを除去するため、基板をPBSで3回洗浄します。基板をPBSで3回洗浄した後、後続の免疫染色工程へと基板を移すことができます。

ピンセットで基材を扱い、免疫染色の最初のステップである透過処理剤への浸漬で反転させることでこれを行います。ここでは、0.2% Triton X含有PBSを使用しています。ただし、ユーザーは自身のニーズに最も適した透過剤を選択して使用してください。

すべての基板に対してこの操作を繰り返し、このようにして免疫染色プロセス中の基板を取り扱います。免疫染色後、基板を標準的な1インチ×3インチのガラススライドにマウントします。これにより、倒立型か正立型かを問わず、あらゆるエピ蛍光顕微鏡で処理することが可能になります。共焦点顕微鏡でサンプルを処理することで、ポストの底部に焦点を合わせ、たわみのないヌルポジション（零点位置）を取得できます。

次に、ポストの先端に焦点を合わせ、ポストの画像をもう一度撮影します。そして、上部の画像と下部の画像を比較することで、ポストのたわみを測定し、そのようなたわみを生じさせるために細胞が生成した牽引力を算出できます。このプロセスを、さまざまな条件下で多くの異なる細胞に対して行うことで、異なる条件で生成された牽引力を比較することができます。生細胞と固定細胞の両方の画像を収集したため、次のタスクは、細胞のたわみを測定し、牽引力を測定することです。

この操作を行うために、MATLABでコンピュータプログラムを作成しました。これらが、今回の解析で使用する3つの画像です。まず、1枚目の画像は細胞の位相画像です。

これは細胞の位置を特定するのに役立ちます。2枚目の画像はポスト上部の蛍光画像です。この画像を使用して、ポスト先端の位置を特定します。

ご覧のように、一部のポストは偏向しており、このように多くのポストが配置されている矩形格子から逸脱しています。こちらのポストも同様です。3枚目の画像はベース画像として使用し、ポストの底部を通過する焦点面におけるポストの位置をキャプチャします。

この段階では、たわんだポストとたわんでいないポストの両方が、静止状態である非たわみ位置にある必要があります。矩形格子において、2番目の画像で底部がたわんでいたポストが、ここではFL位置にあることがわかります。この画像は、ポストの非たわみ位置を特定するために使用されます。

次に、MATLABプログラムを読み込みます。すると、これら3枚の画像を読み込むよう指示が表示されます。ファイルに名前を付けてください。位相画像が表示されます。

細胞の位置を示す枠を描画し、プログラムがどのポストを分析すべきかを認識させます。その後、プログラムは切り出された画像の強度処理、閾値設定、および二値化を行い、ポストのOID座標を決定します。左側には上部画像から抽出されたポストの二値化画像が、右側には基底画像から抽出された同一ポストの二値化画像が表示されています。

ポストとOID座標を取得した後、プログラムは各ポストの先端と基部の間の変位ベクトルを決定できます。これらのポスト変位ベクトルにポストのばね定数を乗じることで、力ベクトルに変換することが可能です。これらの細胞力は、細胞あたりの平均力やポストあたりの平均力など、さまざまな方法で分析できます。

有用な結果のひとつとして、力の空間分布を可視化できるクィバー図（ベクトル図）が挙げられます。これは先ほど解析した細胞であり、ポスト上に黄色の矢印を重ねて表示しています。この矢印は、力の大きさに相関した長さで、力が働く方向を指しています。タイムラプス動画に必要な一連の画像に対してこの画像解析プロセスを繰り返すことで、時系列データを作成することが可能です。

ここでは、血清で刺激した細胞の動画を示します。見ての通り、血清が添加された直後に細胞の収縮性が増し、ポストがさらに大きく偏向しています。加えて、異なる条件下に置かれ、その後固定・染色されたより多くの細胞の力を定量化することが可能です。例として、コントロール化合物で処理した細胞と、収縮抑制剤で処理した細胞を比較したこれらのクィバープロットを示します。

ご覧の通り、コントロール群における細胞に働く力ベクトルは、収縮抑制剤を使用した2つのケースにおける力ベクトルよりも、長さおよび大きさが大きくなっています。マイクロファブリケーションからサンプル調製、実験、そして解析に至るまで、これらの基質の汎用性を示すために、ここでは多くの内容を説明しました。

ライブセルイメージングと固定試料アッセイという2つの異なるアッセイについて説明し、これら両方のアッセイから得られた細胞の解析を行い、クィバープロットとクィバームービーを示しました。この強力なツールを用いることで、細胞の収縮性に関する多様な空間的および時間的解析を行うことができます。ご覧いただいた通り、この手法は、マイクロファブリケーション、基礎細胞生物学、表面科学、画像解析および処理など、多くの異なる分野の知見に基づいています。

本手法は複数の異なる工学的技術に基づいているため、ポストの形状や誘導される可溶性因子、ポストのたわみを分析する方法などのパラメータを、ユーザーのニーズに応じてカスタマイズすることが可能です。過去20〜30分にわたって概説した本手法の視覚的なデモンストレーションが、細胞牽引力の調節、機能的結果、および生成に関するさらなる深い分析の出発点として活用されることを期待しています。