ヒト人工多能性幹細胞をトランスフェクトしNucleofecting

この実験の全体的な目的は、最適化されたトランスフェクションおよび核導入プロトコルを用いて、ヒト人工多能性幹細胞において高いトランスフェクション効率を達成することです。これは、まずヒト人工多能性幹細胞のフィーダーフリー培養を確立することによって行われます。トランスフェクションに向けて、ヒト人工多能性幹細胞をgelt、TRX、またはmatrigel上に一晩播種します。

核注入を行う際は、トリプシンを用いて小さな細胞塊を得た後、プラスミドDNAとGene l Juice核導入試薬の混合液を播種した細胞に添加し、プレートを遠心分離し 37 °Cでインキュベートします。ヒトiPS細胞懸濁液を核注入装置で核注入し、細胞をMEM条件付き培地で再懸濁して 37 °Cでインキュベートします。最終的に、ヒトiPS細胞において高い導入効率による効率的な遺伝子操作の結果を得ることができます。

以前に報告されたトランスフェクション、エレクトロポレーション、および核注入法などの既存の手法と比較して、本手法の主な利点は、当研究室において一貫した結果を伴う高いヒトiPS細胞へのトランスフェクション効率を日常的に達成できることです。また、当研究室のプロトコルは、遺伝子改変後の細胞死を最小限に抑えることができます。したがって、本プロトコルにより、トランスジェニックヒトiPS細胞株の迅速かつ大規模な作製が可能となります。ヒト人工多能性幹細胞をフィーダーフリー培養に適応させる前に、Geltrexコート済みディッシュを準備してください。

次に、フィーダー細胞上で維持していたヒトIPCsに、1ウェルあたり1 mLのAccutaneを加え、37 °Cで1分間、またはほとんどの細胞が剥離し始めるまでインキュベートします。細胞に10〜15個のガラスビーズを加え、プレートを軽く揺らします。その後、2 mLのknockout D-M-E-M-F 12を加え、穏やかにピペッティングして分散させます。細胞懸濁液を10 mL centrifuge tubeに回収します。

室温で800 RPMで3分間、細胞を遠心分離します。上清を吸引し、ヒトiPS細胞のペレットをそのまま残します。チューブを軽く叩き、細胞ペレットを穏やかに分散させます。

Reese、ヒトiPS細胞ペレットを適切な量のSTEMpro培地で懸濁し、gel TREコートプレートの各ウェルに分注してください。増殖速度に応じて、ヒトiPS細胞は1:2から1:6の分割比で継代できます。プレートを5% CO2、37 °Cのインキュベーターに慎重に設置し、プレートを軽く揺らして細胞が各ウェルに均一に分布するようにしてください。

細胞に毎日培地を供給します。細胞が80%のコンフルエンシーに達したら、新しいゲルへと継代する準備が整ったことになります。最適な導入効率を得るためには、トランスフェクション当日に、分割比1:2でRexコーティング済みウェルに播種した細胞が、約40%から50%のコンフルエンシーであり、小さなコロニーとなってゲルコーティング済みウェル上に均一に分散している必要があります。

この手順を開始するために、滅菌済みの1.5 mLエッペンドルフチューブに100 µLのノックアウト培地を用意します。27 µLのGene Juiceトランスフェクション試薬を加え、よく混ぜて室温で5分間インキュベートします。次に、4 µgのプラスミドDNAを加えます。

最適なトランスフェクション効率を得るためには、プラスミドの選択が極めて重要です。本手法で使用するプラスミドは、ヒトIPCにおいて転写活性の高い強力なプロモーターであるCAGプロモーターによって駆動される増強緑色蛍光タンパク質を有しています。チューブを室温で15分間インキュベートします。

15分後、gene juiceおよびDNA混合液を細胞に添加し、プレートを揺らして広げます。プレートを1,200 RPMで5分間遠心分離し、ウェル内のヒトIPCとトランスフェクション混合液との接触を促進させます。細胞を37 °Cで一晩インキュベートし、翌日に進みます。

核導入効率を確認するため、核導入当日にヒトiPS細胞を10 µMのROCK阻害剤で37 °Cで少なくとも1時間前処理します。ヒトiPS細胞の前処理を行っている間に、滅菌済みの1.5 mLエッペンドルフチューブにヒト幹細胞核導入用溶液を82 µL準備します。そこに80 µLを加えます。

補完し、ピペッティングしてよく混ぜ合わせます。溶液を37 °Cで5分間インキュベートします。あらかじめ準備したフィーダー細胞馴化培地と0.25% Trypsin-EDTAを、フード内で37 °Cに予温します。

滅菌済みの15 mLコニカルチューブ1本にラベルを貼ります。核を抽出するヒトiPS細胞の培養液を注意深く取り除き、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を穏やかに洗浄します。PBSを吸引し、トリプシンを加えて37 °Cで3分間細胞をインキュベートします。

核への導入（nucle affection）を成功させるには、細胞をトリプシン処理して単一細胞にすることを避けることが極めて重要です。代わりに、細胞を2〜3個の細胞からなる小さな塊になるまでトリチュレーションしてください。P 1000ピペットチップを用いて細胞を穏やかにピペッティングし、2〜3個の細胞からなる小さな塊にします。

ピペットで繰り返し洗浄し、すべてのヒトIPCが完全に剥離していることを確認します。その後、細胞懸濁液をラベル貼付済みの15 milliliterコニカルチューブに移します。次に、9 milliliterのマウス胚性線維芽細胞用培地を加えます。

トリプシンを不活化させるため、細胞を800 RPMで3分間遠心分離します。細胞ペレットを壊さないように注意しながら、上清を吸引除去します。その後、あらかじめ加温しておいたヒト幹細胞核抽出用溶液100 µLに細胞を懸濁させます。

1 mL ピペットチップを用いて、細胞を核エフェクターチューブに移します。細胞懸濁液に 4 µg のプラスミドDNAを加え、チューブを優しく回旋させて細胞とDNAを混合します。チューブをフードの表面に2回軽く叩きます。

キュベットを核エフェクター装置の核エフェクターホルダーに挿入します。ボタンxを押し、プログラムB 0 1 6核エフェクト細胞を選択します。通常1〜5秒で核エフェクト処理が完了すると、「Okay」が表示されます。核エフェクトキットに付属のプラスチック製パステールピペットを使用して、キュベットから核エフェクト後の細胞を回収します。あらかじめ37 °Cに温めておいたCMおよびROCK阻害剤を含む滅菌済みの1.5 mLエッペンドルフチューブに細胞を懸濁させて回収し、37 °Cで10分間インキュベートします。

10分後、1 mLのピペットチップを用いて、細胞をフィーダー層上に滴下するように転移します。細胞を37 °Cで一晩インキュベートし、翌日にトランスフェクション効率を確認します。

ここでは、Gene Juiceを用いてトランスフェクションし、プラスミドDNAを導入してから12時間後の、EGFPを発現するRIV oneヒトiPS細胞の顕微鏡写真を示しています。ヒトiPS細胞へのGene Juiceを用いたDNAトランスフェクションにおいて、強力なプロモーターを使用すると、通常、一過性トランスフェクションアッセイで60%以上のEGFPレポーター発現細胞が得られます。

EGFP発現細胞は、核注入によっても得ることが可能です。これらの画像は、B 0 1 6核注入プログラムまたはA 0 2 3核注入プログラムを用いて核注入を行い、フィーダー層上に播種して形成させたRIV oneヒトiPS細胞を示しています。B 0 1 6プログラムの使用では、最大80%のEGFP陽性細胞が得られましたが、A 0 2 3プログラムではEGFP陽性細胞は10%未満でした。さらに、トランスジーンを発現するトランスジェニックヒトiPS細胞の安定クローンを誘導することが可能です。

GeneJuice由来の普遍的なEGFP発現を有する、安定的にEGFPを発現するヒトiPS細胞コロニーの例をここに示します。これらの細胞は、胚様体分化の間も構成的なEGFP発現を維持します。このビデオを視聴することで、ヒトiPS細胞への核注入およびトランスフェクションの方法について十分に理解できるはずです。

効率的な遺伝子操作は、幹細胞生物学のさまざまな側面を研究するための不可欠なツールであり、再生医療におけるヒトiPS細胞株の利用を加速させるものです。