Name: ヒト人工多能性幹細胞をトランスフェクトしNucleofecting (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 学ぶ ヒトiPS細胞への高効率トランスフェクションとNucleofectionの最適化プロトコル。フィーダー非依存培養と遺伝子導入技術を用いて、細胞死を最小限に抑えながらトランスジェニックiPS細胞株を迅速に樹立する方法です。

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本稿で説明する作業はUCRの幹細胞Coreのカリフォルニア再生医療研究所（CIRM）からの資金によって可能となった。

我々のプロトコルはGeneJuice（EMD）とAMAXA nuclefector装置を用いてヒトの性IPSCのクレオを用いてヒトの性IPSCをトランスフェクトするためのプロトコルが続くフィーダーフリー培養に人間性IPSCを適応させる方法で始まります。 注：以下の手順は、無菌層流フード内で実行されます。すべてのメディアおよびソリューションは、37℃以上、特に断らない限り起動する前に室温に戻しています。 1。フィーダーフリーシステムに人間性IPSCの確立以前にフィーダー細胞上で維持人間性IPSCは、分割Geltrexコーティングされた皿に移して、フィーダーフリートランスフェクションの前に2つの通路を維持することができる。 <ol><li> 4℃で一晩Geltrexを解凍Geltrexコーティングを準備するには、冷たいDMEM中で解凍Geltrex 1:50に希釈します。優しくソリューションを混ぜる。 </li></ol>注：Geltrex、マトリゲルなどが基底膜MATRの可溶性形態であるixはネズミEngelbreth·ホルム·スウォーム（EHS）腫瘍細胞から精製した。あるいは、マトリゲルをフィーダーフリー人間IPSC文化を確立するために細胞外マトリックスとして使用することができます。 <ol start="2"><li> Geltrex溶液（35-mmの1ミリリットルウェル）で培養ウェルの表面全体を覆​​う。 37℃Geltrex付きコート井戸℃で1時間インキュベーター。 </li><li>ほとんどの細胞が剥離し始めるまで通路人間性IPSCに、ウェル当たりaccutaseの1ミリリットルを加え、1分間37℃でインキュベートする。 </li></ol>ほとんどの細胞が剥離し始めるまで通路人間性IPSCに、ウェル当たりaccutaseの1ミリリットルを加え、1分間37℃でインキュベートする。 <ol start="4"><li>細胞がゆっくりと渦プレートを10から15にガラスビーズを追加します。ノックアウトDMEM / F12の2ミリリットルを加え、穏やかにひいて粉にする。 10 mlの遠心チューブに細胞懸濁液を移す。 </li><li>室温で3分間800rpmで細胞をスピン。 </li><li>人間IPSCペレットはそのままにして、チューブから上清を吸引します。優しくチューブをフリック細胞ペレットを分散させる。 </li><li>コー​​ティングされた井戸からGeltrexを削除します。 </li><li>優しくSTEMPROの適切な音量で人間IPSCペレットを再懸濁します。 ）増殖速度に応じて、フィーダーのウェル間で配布しています。人間性IPSCは、1:2〜1:6の分割比で継代することができる。 </li><li>慎重に所定の位置5％CO 2インキュベーター、慎重にスワールプレートのウェルを越えた細胞の均一な分布を確実にするために。 </li><li>細胞まで、毎日のフィード細胞は（細胞が80％コンフルエントに達したとき）を再度分割する準備が整いました。 </li><li> 1:2の分割比で新しいGeltrexコーティングされた井戸の上に通路人間性IPSC（ステップ1.3から1.9）。小さなコロニーが形成され、よくGeltrexコーティングされたトランスフェクションの前に均等に分配されるべきである。 </li></ol> 2。 GeneJuiceと人間性IPSCのトランスフェクション細胞（6ウェルプレート上で増殖）最適なトランスフェクション効率を達成するために、トランスフェクションの日に合流、約40〜50％であるべきである。それは翌日まで細胞培地を変更する必要はありません。 <ol><li>滅菌済み1.5mlエッペンドルフチュー​​ブに100μlのKO-DMEM/F12を準備します。 27μlのGeneJuiceトランスフェクション試薬を追加します。よく混ぜる。 5分間室温でインキュベートする。 </li><li> 4μgのプラスミドDNAを追加。 15分間室温でチューブをインキュベートする。プラスミドの選択が最適なトランスフェクション効率のために重要です。我々はプロモーター5（pCAG-EGFP）をCAGによって駆動増強された緑色蛍光タンパク質（EGFP）を有するプラスミドを使用しています。 CAGプロモーターと人間性IPSCにおける転写活性であり、したがって、これらの細胞に導入遺伝子の発現を駆動するために使用することができる強力なプロモーターである。我々の手では、プラスミドの線形化は、トランスフェクション効率に影響を与えていないようでした。 </li><li>細胞やスワールプレートにGeneJuice-DNA混合物を追加します。十分に人間性IPSCでトランスフェクション混合物の接触を高めるために5分間1200rpmで（ 'spinoculation'メソッド）でプレートを回転させる。 </li><li> 37＆で細胞をインキュベート度、Cで一晩。 </li><li>翌日、トランスフェクション効率を監視する。 </li><li>安定したトランスフェクションのために、新鮮なSTEMPROで翌日培地を変更してください。 48時間 - 24の後に適切な抗菌薬の選択を追加します。 </li></ol> 3。人間性IPSCのヌクレオフィーダまたはGeltrex上に成長させた人間性IPSCはクレオのために使用することができます。しかし、我々は強く高い細胞生存率と回復を確実にするために、マウス胚線維芽細胞（MEF）またはヒト包皮線維芽細胞（HFF）のフィーダにnucleofected人間性IPSCを再播種をお勧めします。少なくとも2万個の細胞は、ヌクレオ以下の高い細胞生存率を達成するために使用されるべきである。 <ol><li>一夜フィーダー細胞を用いてヒトIPSCノックアウト血清代替（KOSR）メディアをインキュベートすることにより、フィーダー細胞馴化培地（CM）を準備します。 CMを24時間ごとに収集します。 </li></ol>注：フィーダー層を製造するために使用される任意のマウス系統（例えば、BLK6、CF1とMF1など）foを使用するのに適していますrはCMを作る。 <ol start="2"><li>クレオの日には、少なくとも1時間、10μMROCK阻害剤との人間性IPSCを事前に処理します。 </li><li>滅菌済み1.5mlエッペンドルフチュー​​ブにヒト幹細胞ヌクレオ液の82μlを準備します。 18μlのサプリメント（1）を加える。よく混ぜる。 5分間37℃で溶液をインキュベートする。 </li><li>プリ暖かいフィーダー細胞馴化培地（CM）および0.25％トリプシン/ EDTAを37℃ボンネットの下に、prelabel 1滅菌15 mlコニカルチューブ。 </li><li>慎重nucleofectedする人間IPSC文化からメディアを削除します。優しくウェル当たり2ミリリットル1Xリン酸緩衝液（PBS）で細胞を洗浄する。 PBSを吸引除去。ウェルあたりの0.25％トリプシンを1mlを加える。 3分37℃で細胞をインキュベートします。 </li><li>そっと千ミリリットルピペットチップを用いて細胞をひいて粉にする。すべての人間性IPSCが完全に切り離されていることを確認するために井戸の底を洗います。ラベルの付いた15mlコニカルチューブに細胞懸濁液を移す。 </li></ol>注：単一のcにトリプシン処理ellsは厳密に避けるべきである。細胞の約三つ子から成っていた細胞が唯一の細胞の小さな塊に外れなければなりません。細胞の小さな塊（セルトリプル）は、細胞のその後の取扱い中に単細胞に解離することになります。 <ol start="7"><li>トリプシンを不活性化するために9ミリリットルMEFのメディアを追加します。 3分間800rpmで細胞をスピン。注意深く上清を吸引し、細胞ペレットをそのままにしておく。 </li><li>ステップ3.3からヒト幹細胞ヌクレオソリューションの温めておいた100μlの細胞を再懸濁する。 </li><li> 1ミリリットルピペットチップを用いてヌクレオキュベットにセルを転送します。 </li><li>キュベット内の細胞懸濁液にプラスミドDNA4μgのを追加します。穏やかな旋回により細胞とDNAを混ぜます。ボンネットの表面に二回キュベットをタップします。 </li><li>ヌクレオホルダーにキュベットを挿入します。プログラムは、B-016を使用しています。ボタンXを押すことによって、細胞をNucleofect </li></ol> &lt; <ok>クレオプロセスがあるときのcomplet&gt;が表示されますED（通常は1〜5秒しかかかりません）。他のヌク​​レオプログラムの使用（-023-033とU-023）は、人間性IPSCからEGFP陽性細胞の10％未満が得られた。 </ok><ol start="12"><li>提供されるパスツールプラスチック製のピペットを使用してキュベットからnucleofectedセルを取得。滅菌済み1.5mlエッペンドルフチュー​​ブに温めておいたCMと、ROCK阻害剤でそれらを再懸濁することにより細胞を回収する。細胞が回復するように10分間37℃で細胞をインキュベートします。 </li><li> 1ミリリットルピペットチップを用いてフィーダー層上に滴下転送細胞。 37℃で一晩細胞をインキュベートします。 </li><li>翌日、トランスフェクション効率を監視する。に安定して導入遺伝子を発現するトランスジェニック人間性IPSCの安定したクローンを導出し、CMとROCK阻害剤で翌日培地を変更してください。 48時間 - 24の後に適切な抗菌薬の選択を追加します。 </li></ol> 4。代表的な結果： <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3110/3110fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> <st geltrex riv1></st>

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</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

顕著な毒性作用と細胞死せずに人間性IPSCに導入遺伝子を導入するための、シンプルで堅牢で再現性の高い技術で提案されたプロトコルの結果。人間性IPSCは、多数の小さなコロニーで最適なトランスフェクション効率を確保するために（1:2）は、細胞の小さな塊（5-10セル）に継代し、高密度でGeltrex上にめっきされるべきである。分化および細胞死を起こしやすい人間IPSCの行では、人間性IPSCの数が多い（最大4×10 6細胞）を単ヌクレオ実験に使用されるべきである。一過性トランスフェクションアッセイは、1日以内に導入遺伝子を発現している人間性IPSCの大きい数字を生成します。安定にトランスフェクトされたIPSCのクローンは、通常7日以内に表示され、これらのトランスジェニックコロニーは3週間以内に取りに行く準備ができているはずです。ここで説明するCAGプロモーターの使用は、EGFPレポーターのユビキタスな発現を確実にします。このような改善の下では、我々のプロトコルは、過剰発現、cを含む、他のアプリケーションに供給することができますonditional誘導、系統特異的レポーターラインの導出、shRNAまたはsiRNAノックダウン、遺伝子ターゲティングと相同組換え。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> EDTAを0.25％トリプシン</td><td>インビトロジェン</td><td> 25200056 </td><td></td></tr><tr><td> 2 - メルカプトエタノール</td><td>インビトロジェン</td><td> 21985-023 </td><td></td></tr><tr><td> 3ミリのガラスビーズ</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 11-312A </td><td>ガラスビーズは、一晩塩酸（HCl）で洗浄し、水酸化ナトリウム（NaOH）と蒸留水で洗い流し、使用前にオートクレーブ滅菌する必要があります。 </td></tr><tr><td> Accutase細胞解離試薬</td><td>インビトロジェン</td><td> A11105-01 </td><td></td></tr><tr><td>塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF） </td><td>インビトロジェン</td><td> PHG0263 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM（高グルコース） </td&gt; <td>ロンザ</td><td> 12から741、F </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td>インビトロジェン</td><td> 16000044 </td><td></td></tr><tr><td> Geltrex </td><td>インビトロジェン</td><td> 12760013 </td><td>成長因子低減</td></tr><tr><td> GeneJuiceトランスフェクション試薬</td><td> EMD Biosciences社</td><td> 70967 </td><td></td></tr><tr><td>グルタマックス-I（100X） </td><td>インビトロジェン</td><td> 35050061 </td><td> L-グルタミン（Invitrogen社、25030081）も代わりに使用することができます。 </td></tr><tr><td>人間IPSC KOSRメディア</td><td></td><td></td><td> 500ミリリットルヒトESメディアは390ミリリットルノックアウトDMEM / F12、100ミリリットルのノックアウト血清代替、5ミリリットルグルタマックス-I（100X）、5ミリリットルNEAA（100X）、500μlの2 - メルカプトエタノール（55ミリメートル）で構成され、10 ng / mlのbFGFを補っ。 </td></tr><tr><td>ノックアウトDMEM/F12 </td><td>インビトロジェン</td><td> 12660-012 </td><td></td></tr><tr><td>ノックアウト血清代替（KOSR） </td><td>インビトロジェン</td><td> 10828-028 </td><td></td></tr><tr><td>マウス胚性線維芽細胞培地</td><td></td><td></td><td> MEFのメディアは、90％のFBS、1X NEAA、1Xグルタマックス-IとDMEM中1Xピルビン酸ナトリウム（高グルコース）で構成されています</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸、NEAA？（100X） </td><td>インビトロジェン</td><td> 11140050 </td><td></td></tr><tr><td>ヒト幹細胞ヌクレオ液1サプリメントで</td><td>ロンザ</td><td> VAPH-5012 </td><td></td></tr><tr><td>リン酸塩は、Ca 2 +およびMg 2せずに緩衝生理食塩水+ </td><td>インビトロジェン</td><td> 10010023 </td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム（100X） </td><td>インビトロジェン</td><td> 11360070 </td><td></td></tr><tr><td> STEMPRO培地キット</td><td>インビトロジェン</td><td> A1000701 </td><td> 500ミリリットルSTEMPROメディアは454ミリリットルノックで構成されていますDMEM / F12、10ミリリットルSTEMPRO無血清増殖サプリメント（50X）、5ミリリットルグルタマックス-I（100X）、5ミリリットルNEAA（100X）、36 mlのBSA（ウシ血清アルブミン、25％）、909μlの2 - メルカプトエタノール（55mmの外）および10 ng / mlのbFGFを補った。 </td></tr></tbody></table>

ヒト人工多能性幹細胞をトランスフェクトしnucleofecting

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

遺伝子改変は、幹細胞生物学を研究することにし、ヒト胚性幹細胞（hESC）1の電位の臨床応用を定めたに不可欠なツールであることを続けています。いくつかの遺伝子送達方法の改善は2-9を説明してきたが、トランスフェクションは、ヒトES細胞のための気まぐれなプロセスのままで、まだ人間の人工多能性幹細胞（性IPSC）に報告されていません。このビデオでは、我々の研究室では日常的に増強された緑色蛍光タンパク質（EGFP）レポータープラスミドを用いてヒトの性IPSCをtransfectsとnucleofects方法をデモンストレーションします。人間性IPSCが適用され、フィーダー細胞のトランスフェクションの可能性を排除し、トランスフェクション後の安定したトランスジェニックIPSCクローンの効率的な選択を可能にするためにフィーダーフリー培養として維持されています。クレオは、人間性IPSCは、細胞馴化フィーダ内フィーダー上nucleofectedと再播種ROCK阻害剤11、細胞の小さな塊にトリプシン処理で前処理される細胞の回収を強化するための媒体である。導入遺伝子を発現している人間性IPSCは、6時間後に取得できます。抗生物質の選択は、24時間後に適用され、安定したトランスジェニック系統は、1週間以内に表示されます。我々のプロトコルはこれらの細胞の多能性を変えることなく、人間のIPSC行するための堅牢で再現性がある。

遺伝子組み換えの最近の進歩にもかかわらず、ヒト胚性幹細胞（hESC）のトランスフェクションは、気まぐれなプロセスのままです。我々の知る限りでは、人間の人工多能性幹細胞（性IPSC）トランスフェクトする体系的かつ効率的な方法が報告されていない。ここでは、効率的にトランスフェクトし、人間性IPSCをnucleofectするための堅牢なプロトコルを記述。

ヒト人工多能性幹細胞をトランスフェクトしNucleofecting

遺伝子改変は、幹細胞生物学の研究およびヒトにおける潜在的な臨床応用の提示において、引き続き不可欠なツールとなっています。

この実験の全体的な目的は、最適化されたトランスフェクションおよび核導入プロトコルを用いて、ヒト人工多能性幹細胞において高いトランスフェクション効率を達成することです。これは、まずヒト人工多能性幹細胞のフィーダーフリー培養を確立することによって達成されます。トランスフェクションのために、ヒト人工多能性幹細胞をgelt、TRX、またはmatrigel上に一晩播種します。核導入については、トリプシンを用いて小さな細胞塊を回収し、プラスミドDNAとGeneJuiceトランスフェクション試薬の混合液を播種した細胞に添加した後、プレートを遠心分離し、37 °Cでインキュベートします。ヒトiPS細胞懸濁液を核導入装置で核導入し、細胞をMeth条件培地で再懸濁して37 °Cでインキュベートします。最終的に、ヒトiPS細胞における高いトランスフェクション効率を通じて、効率的な遺伝子操作が行われた結果を得ることができます。以前に報告されたエレクトロポレーションによるトランスフェクションや核注入法などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、ヒトiPS細胞において、一貫した結果を伴う高いトランスフェクション効率を当研究室で日常的に達成できることです。また、当研究室のプロトコルでは、遺伝子改変後の細胞死を最小限に抑えることができます。したがって、本プロトコルを用いることで、トランスジェニックヒトiPS細胞株を迅速かつ大規模に作製することが可能です。ヒト人工多能性幹細胞をフィーダーフリー培養に適応させる前に、ゲルトリン（Geltrex）コーティング済みのディッシュを準備してください。次に、フィーダー細胞上で維持していたヒトIPCに、1ウェルあたり1 mLのAccutaneを加え、37 °Cで1分間、またはほとんどの細胞が剥離し始めるまでインキュベートします。その後、10〜15個のガラスビーズを細胞に加え、プレートを穏やかに揺らします。続いて、2 mLのknockout D-M-E-M-F 12を加え、穏やかにピペッティングします。この細胞懸濁液を10 mL centrifuge tubeに移します。室温で800 RPMで3分間、細胞を遠心分離します。ヒトiPSCペレットを保持したまま、上清を吸引除去します。チューブを軽く叩き、細胞ペレットを優しく分散させます。Reese、ヒトiPSCペレットを適切な量のSTEMpro培地で懸濁し、gel TREコートプレートの各ウェルに分注してください。増殖速度に応じて、ヒトiPCは1:2から1:6の分割比で継代させることができます。プレートを5% carbon dioxide、37 degrees Celsiusのインキュベーターに慎重に設置し、プレートを軽く揺らして細胞が各ウェルに均一に分布するようにしてください。細胞には毎日培地を供給してください。細胞密度が80%に達したら、新しいゲルへの継代が可能です。最適なトランスフェクション効率を得るためには、トランスフェクション当日に、1:2の分割比でRexコーティングされたウェルに播種した細胞の密度が約40〜50%であり、小さなコロニーとなってゲルコーティングされたウェル上に均等に分散している必要があります。この手順を開始するには、滅菌済みの1.5 mLエッペンドルフチューブに100 µLのノックアウト培地を用意します。27 µLのGeneJuiceトランスフェクション試薬を加え、よく混ぜて室温で5分間インキュベートします。次に、4 µgのプラスミドDNAを加えます。最適なトランスフェクション効率を得るためには、プラスミドの選択が極めて重要です。本手法で使用するプラスミドは、ヒトIPCにおいて転写活性の高い強力なプロモーターであるCAGプロモーターによって駆動される、強化緑色蛍光タンパク質（enhanced green fluorescent protein）を搭載しています。チューブを室温で15分間インキュベートします。15分後、遺伝子ジュース（DNA混合液）を細胞に添加し、プレートを揺らして混ぜ合わせます。ウェル内のヒトIPCとトランスフェクション混合液の接触を増やすため、プレートを1,200 RPMで5分間遠心分離します。その後、細胞を37°Cで翌日まで一晩インキュベートします。核移行効率を確認するため、核移行処理を行う日に、ヒトiPCを10 µMのROCK阻害剤で37 °Cで1時間以上前処理します。ヒトiPCの前処理を行っている間に、滅菌済みの1.5 mLエッペンドルフチューブにヒト幹細胞核移行溶液を82 µL準備します。そこに80 µLを添加します。サプリメントを1つ加え、ピペッティングしてよく混ぜ合わせます。溶液を37 °Cで5分間インキュベートします。あらかじめ調製しておいたフィーダー細胞条件化培地および0.25% Trypsin-EDTAを、クリーンベンチ内で37 °Cに予熱します。滅菌済みの15 mLコニカルチューブ1本にラベルを貼ります。核転換を行うヒトiPSC培養液から培地を慎重に取り除き、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を穏やかに洗浄します。PBSを吸引し、トリプシンを加えて37 °Cで3分間細胞をインキュベートします。核酸導入を成功させるには、トリプシン処理で細胞を単一細胞にまで分散させないことが重要です。代わりに、細胞を2〜3個の細胞からなる小さな凝集塊になるようにトリチュレーション（物理的分散）してください。P1000ピペットチップを用いて細胞を穏やかに再懸濁し、2〜3個の細胞からなる小さな凝集塊にします。ウェル底を繰り返しピペッティングして洗浄し、すべてのヒトIPCが完全に剥離したことを確認します。次に、細胞懸濁液をラベル付けした15 milliliterコニカルチューブに移します。続いて、マウス胚性線維芽細胞用培地を9 milliliters加えます。トリプシンを不活化させるため、細胞を800 RPMで3分間遠心分離します。細胞ペレットを壊さないよう、注意深く上清を吸引します。その後、あらかじめ加温したヒト幹細胞核抽出用溶液100 µLで細胞を懸濁させます。1 mLピペットチップを用いて、細胞を核エフェクターチューブに移します。細胞懸濁液に4 µgのプラスミドDNAを加え、チューブを穏やかに回転させて細胞とDNAを混合します。チューブをフードの表面に2回軽く叩きます。核エフェクターデバイスの核エフェクターホルダーにビュエットを挿入します。ボタンxを押し、プログラム B 0 1 6 nuclear effect cells を選択します。通常1～5秒で核エフェクト処理が完了すると、Okayが表示されます。核エフェクトキットに付属のプラスチック製パスタピペットを使用して、ビュエットから核エフェクト細胞を回収します。あらかじめ加温したCMおよびrock inhibitorを入れた滅菌済みの1.5 milliliter eend orphで再懸濁して細胞を回収し、37 °Cで10分間インキュベートします。10分後、1 mL ピペットチップを用いて、細胞をフィーダー層の上に滴下して移します。細胞を 37 °C で一晩インキュベートし、翌日に導入効率を確認します。ここでは、GeneJuiceを用いて transfection された EGFP 発現 RIV one ヒト iPSC 細胞の、プラスミド DNA transfection から 12 時間後の GelRed 染色の顕微鏡写真を示します。強力なプロモーターを備えた GeneJuice を用いてヒト iPSC に transfection を行うと、通常、一過性 transfection アッセイにおいて 60% 以上の EGFP レポーター発現細胞が得られます。EGFP発現細胞は、核注入によっても得ることが可能です。これらの画像は、B 0 1 6核注入プログラムまたはA 0 2 3核注入プログラムを用いて核注入を行い、フィーダー細胞上に播種して形成させたRIV oneヒトiPS細胞を示しています。B 0 1 6プログラムを使用した場合は最大80%のEGFP陽性細胞が得られましたが、A 0 2 3プログラムではEGFP陽性細胞は10%未満でした。さらに、トランスジーンを発現する導入遺伝子組換えヒトiPS細胞の安定クローンを誘導することも可能です。ここに、GeneJuice由来の普遍的なEGFP発現を持つ、安定的にEGFPを発現するヒトiPS細胞コロニーの例を示します。これらの細胞は、胚様体分化の間も構成的なEGFP発現を維持します。このビデオを視聴することで、ヒトiPS細胞への核導入およびトランスフェクションの方法について十分に理解できるはずです。効率的な遺伝子操作は、幹細胞生物学のさまざまな側面を研究するための不可欠なツールであり、再生医療におけるヒトiPS細胞株の利用を加速させるものです。

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Stemgent Doxの誘導性マウスTFのレンチセットは、人工多能性幹（iPS）細胞に、マウス胚性繊維芽細胞（MEF）を再プログラムすることができます。ここでは、マウスプログラミング転​​写因子Oct4のDOX誘導性発現のためのプロトコルを示す、レトロウイルスベクター、KLF4およびc -...

4つの転写因子とマウス胚線維芽細胞を再プログラムすることによって誘導多能性幹細胞の生成、ドキシサイクリンは、レンチウイルス伝達系の誘導性

我々は、人的要因Oct4は、レトロウイルスベクター、Nanogの、そしてLin28のレンチウイルスを介した配信を用いてヒトの体細胞から誘導多能性幹細胞の生成のためのプロトコルを示す。多分化能は、形態と胚性幹（ES）細胞特異的マーカーの存在によって確認された。...

StemgentヒトTFのレンチセットでヒト線維芽細胞を再プログラムすることによって誘導多能性幹細胞の生成

大人の線維芽細胞から再プログラムヒト人工多能性幹細胞のコロニーを選択し、分離

OCT4、SOX2、KLF4とMYCのレトロウイルス媒介性異所性発現を介してヒトの人工多能性幹細胞（性IPSC）を生成する方法が記載されている。...

GFPをレトロウイルスベクターを用いた誘導多能性幹細胞（性IPSC）にヒト体細胞を再プログラミングする

ここでは、一貫性のある成果と効率向上を示しているセンダイウイルスと導入遺伝子のない人間性IPSCにヒト体細胞を再プログラムする当社の確立された手法を提案する。...

仙台ウイルスのヒト体細胞からの効率的な次世代ヒューマン誘導多能性幹細胞

私たちは、レンチビラールベースの再プログラムされ、特徴付けられた因子フリーのヒト誘導多能性幹細胞を導き出し、推定される臨床グレードの状態に変換するためのプロトコルを記述します。...

導入遺伝子のない人間の人工多能性の導出および特徴は、定義された臨床グレードの条件に細胞株および変換の幹

このプロトコルは、転写因子の強制発現を通じて、ヒト多能性幹細胞からの血行性内皮および多能性造血前駆細胞の効率的な誘導について説明しています。...

ヒト多能性幹細胞における転写因子の過剰発現によって、造血内皮と血液の直接誘導

この原稿は、抜毛された髪の毛からのヒトケラチノサイトの誘導と維持、およびその後のエピソームベクターによる統合フリーのヒト人工多能性幹細胞（hiPSCs）の生成のための段階的な手順を提供します。...

髪の由来ケラチノサイトを使用した統合フリーヒト誘導多能性幹細胞の生成

シームレスなゲノム編集によるヒト多能性幹細胞への点突然変異の導入

学ぶ ヒトiPS細胞への高効率トランスフェクションとNucleofectionの最適化プロトコル。フィーダー非依存培養と遺伝子導入技術を用いて、細胞死を最小限に抑えながらトランスジェニックiPS細胞株を迅速に樹立する方法です。

ヒト人工多能性幹細胞をトランスフェクトしNucleofecting

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