蛍光活性化細胞選別を用いたマウス網膜神経節細胞の単離

網膜を湿らせた細胞ストレーナーの上に置き、円を描くように浸軟させて、網膜細胞を細胞外マトリックスから分離します。

ストレーナーを収集チューブに移します。

酸緩衝液と血清溶液をストレーナーに加えて、細胞を洗浄して収集します。

遠心分離機で細胞を沈殿させます。上清を廃棄し、細胞をリン酸緩衝液と血清溶液に再懸濁します。

細胞上のFc受容体に結合するブロッキング抗体を添加し、標的抗体の非特異的結合を防ぎます。

次に、さまざまな細胞型の特定の細胞表面マーカーに結合する蛍光タグ付きおよびタグなしの一次抗体を追加します。

結合していない抗体を洗浄して除去します。

蛍光タグ付き二次抗体を添加して、タグなしの一次抗体に結合します。

結合していない抗体を洗浄して除去します。

蛍光活性化細胞選別(FACS)を実行して、標識細胞の異なる蛍光シグナルを捕捉し、さまざまな網膜細胞集団から網膜神経節細胞を選別します。

PBSとFBSで湿らせた滅菌70ミクロンのナイロンストレーナーに最大12個の網膜を置き、円を描くように10ミリリットルのシリンジプランジャーの後端で網膜を穏やかに浸軟させます。すべての細胞が解離したら、ストレーナーをポリプロピレン収集チューブの上に置き、P1000ピペットを使用して、ストレーナーを介して細胞をろ過して収集チューブに送ります。

ストレーナーをPBSとFBSですすぎ、洗浄液を収集チューブにプールします。十分なPBSとFBSを加えて、網膜あたり最大1ミリリットルの溶液に最終容量を上げ、遠心分離によって細胞を収集します。次に、ペレットをPBSとFBSに網膜濃度5あたり1ミリリットルの培地で再懸濁します。次に、1 x 10⁶細胞あたり1マイクロリットルの抗マウスCD16/32抗体で、各チューブ内の非特異的FC受容体結合を室温で10分間ブロックします。

ブロッキングインキュベーションの最後に、目的の抗体カクテルを穏やかなピペッティングで細胞に加え、光から保護された氷上で30分間インキュベートします。次に、4ミリリットルのPBSおよびFBSの最終容量で細胞を2回洗浄します。光から保護された氷上でさらに30分間、適切な二次抗体で細胞を標識し、その後PBSとFBSで2回洗浄し、サンプルチューブをフローサイトメーターにロードします。