細胞ネットワークの作成のためのプラズマのリソグラフィ表面パターニング

本実験の全体的な目的は、マイクロおよびナノスケールで起こる個々の細胞および細胞集団の挙動に関する生物学的課題を研究するための細胞微小環境を構築することです。これは、まず最終的に細胞の配置を誘導するためのテンプレートを設計することで達成されます。次に、これらの設計をフォトリソグラフィーによってパターン表面へと変換し、それを用いてソフトリソグラフィーによりプラズマ遮蔽モールドを作成します。

最後に、これらの遮蔽モールドをペトリ皿の中で三脚状に配置し、下層表面をプラズマに選択的に曝露させます。これにより、各モールドの下の領域に細胞感作性の化学パターンが形成されます。その結果、細胞の挙動が微小環境や隣接細胞との相互作用にどのように依存しているかを示すデータを得ることができます。この手法は、細胞集団間の相互作用が高次現象にどのような影響を与えるかなど、微小環境が細胞挙動に及ぼす影響に関する重要な問いに答えるのに役立ちます。

また、細胞内のナノスケールの手がかりは、健全な遊走や分化などの機能にどのように影響するのでしょうか。まず、瞬間接着剤を使用して、パターンスライドを空白スライドのスタックに貼り付けます。次に、スライドのスタックよりもわずかに大きく、30 gのポリジメチルシロキサン（PDMS）を保持できる大きさのアルミホイルの容器を作成します。

スライドのスタックを容器に入れ、その上にPDMSを注いで初期金型を作成します。次に、容器を真空チャンバーに入れてPDMSを脱気します。吸気バルブのチューブを指で数回素早く押したり離したりして、チャンバー内に短時間空気を流入させ、PDMS内の気泡を破裂させてください。

バルブを閉じて5分間、中断することなく脱気を行います。その後、クリーンフローフード内で室温にて1〜2日間、PDMSを硬化させます。硬化した後、PDMSをマスターパターンから剥がし、金型を作成します。

次に、混合後1分間の2液混合型エポキシ樹脂6 gを、マスターモールドに薄く注ぎます。エポキシ樹脂が硬化する前に、バブルブレイキングサイクルを繰り返し行い、直ちに脱気します。脱気したエポキシ樹脂を1時間静置すると、部分的に硬化します。

脱気せずに型にエポキシ樹脂をさらに追加し、後の工程で扱いやすくなるよう、より厚い構造を作成します。その後、エポキシ樹脂を1〜2日間硬化させます。エポキシ樹脂の型が硬化したら、PDMSマスターモールドからエポキシ樹脂を取り出し、エポキシ型の周囲にテープを巻いて容器を形成します。

次に、エポキシ型にPDMSを流し込み、PDMSを脱気し、新しい型を1〜2日間硬化させることで、ワーキングモールドを作成できます。ワーキングモールドの硬化後、型をエポキシから剥がし、清潔さを維持するため、両方をペトリ皿に入れ、フローフード内の密閉プラスチック容器に保管します。表面パターニング用の型を準備するには、カミソリでワーキングモールドを小さく切り分け、それらの断片をペトリ皿に入れます。

これらのモールドセクションの配置場所を、シャーレの裏側に油性マジックで、モールドセクションが置かれている位置を囲むように印付けします。セクションを用いて三脚状の支持構造を作り、作業用モールドとシャーレ表面との密着を確実にするために、三脚に重しを載せて固定します。シャーレの底面を確認し、肉眼または小型の拡大鏡で確認できるチャネルが存在することから、適切に配置されていることを確認してください。その後、アセンブリをプラズマチャンバーに入れます。

プラズマ処理の後、プラズマ処理を開始します。型と重りの配置を取り除き、滅菌のため、シャーレをバイオセーフティキャビネット内のUVライトの下に10分間置きます。細胞を播種するまで、シャーレをそこに保管します。

選択した実験用細胞を標準的な培養培地で希釈し、目的のコンフルエンスにします。パターン形成されたペトリ皿の表面に配置する際、細胞懸濁液3 mLをペトリ皿に注入します。パターン形成されたペトリ皿を37 °C、5% carbon dioxide、100% 湿度の条件下で数時間から数日間インキュベートし、プラズマ細胞によって作成されたパターン上に細胞を凝集させます。

パターン形成は位相差顕微鏡で確認します。神経芽細胞を培養する場合、細胞がニューロンのような状態に分化するまで、10 µMのレチノイン酸を毎日添加してください。標準的な細胞培養培地は3〜4日ごとに交換します。

プラズマリソグラフィー技術を実装した際の典型的な結果は、任意の構造や自然構造に似た細胞パターンの形成です。その例として、レチノイン酸を用いて線状のパターン上で分化したニューロンを、こちらの図でご確認いただけます。また、こちらの図では、ニューロンの線状およびネットワーク構造が作成されています。次の2つの図に見られるように、ニューロン以外の細胞型も利用可能です。こちらの図はヒト臍帯静脈内皮細胞を、そしてこちらの図は C2C12 骨格筋細胞が、見ての通り格子状に形成されている様子を示しています。

ポリリシンなどの材料をパターニングすることで、特定の細胞種の接着を促進させたり、その他の用途に利用したりすることも可能です。この手順に続いて、マイクロフルイディクス、細胞プロービング、あるいは特定のタンパク質の遺伝子操作などの追加的な入力を導入することで、刺激の組み合わせが高次および個々の細胞挙動にどのような影響を与えるかといった、さらなる問いに対する検討を行うことができます。