人工多能性幹細胞の神経前駆細胞への分化

マウス胚性線維芽細胞(MEF)の接着培養物を含むマイクロプレートを培地中で取ります。

接着したMEFはフィーダー層として機能し、支持的な細胞培養微小環境を提供します。

培地を除去し、細胞生存率を高める小分子を添加したhiPS細胞培地にヒト人工多能性幹細胞(hiPSC

hiPS細胞がフィーダー層に付着し、hiPS細胞の増殖を促進する成長因子を分泌するようにインキュベートします。

培地を取り出し、酵素溶液を加えて細胞を剥離します。細胞を移して遠心分離し、上清を除去し、hiPSC培地に再懸濁します。

細胞をバイオポリマーでコーティングされたプレートに移します。MEFが接着できるようにインキュベートします。

懸濁したhiPS細胞をV底マイクロプレートに移します。細胞を遠心分離してインキュベートし、細胞凝集体の形成を誘導します。

分化培地を補充します。培地の栄養素と凝集体内の細胞間相互作用は、hiPS細胞の神経前駆細胞への分化を促進します。

このプロトコルでは、フィーダーセルの確立から始めます。この培養を確立するには、600,000個のフィーダー細胞を6ウェルプレートの各ウェルにプレートし、ウェルあたり300ミリリットルの培地をプレートします。フィーダー細胞を48時間培養した後、培地を交換し、幹細胞を調製しながらプレートを1時間インキュベートします。

幹細胞を摂氏37度のウォーターバスで解凍します。解凍したら、細胞を15ミリリットルの円錐形チューブに移し、チューブに培地を5ミリリットルまで充填し、滴下します。次に、細胞を4分間穏やかに遠心分離します。上清を吸引し、ペレットをROCK阻害剤を含む1ミリリットルの幹細胞培地に穏やかに再懸濁します。

細胞密度を定量化した後、300,000個の幹細胞をフィーダー細胞にプレートします。次に、培養物を成長させて拡大し、健康な細胞を定期的に選択します。バックアップのために細胞を増殖および凍結した後、幹細胞のコロニーを標準プレート上で50%から70%のコンフルエンスに達するまで増殖させます。

次に、穏やかな酵素処理を使用し、1ミリリットルのピペットチップで穏やかな滴定を行い、神経前駆細胞分化のためにHIPSCを回収します。懸濁液を穏やかに遠心分離し、上清を吸引し、ペレットを5ミリリットルのヒトiPS細胞培地に再懸濁します。次に、細胞懸濁液を0.1%ゼラチンでコーティングした5センチメートルの細胞培養皿に移し、プレートを1時間インキュベートします。

1時間後、非接着細胞を15ミリリットルの遠心分離管に移します。次に、プレートを3ミリリットルの培地で優しくすすぎ、同じチューブに移します。次に、穏やかな遠心分離で再懸濁ステップを繰り返します。

次に、細胞密度を測定し、ウェルあたり9,000細胞で96ウェルの低接着Vボトムプレートに細胞をプレーティングします。次に、プレートを3分間回転させ、細胞の培養を開始します。次の14日間、1日おきに、培地の半分を新鮮な分化培地に交換します。