マウス毛包における機械的に刺激された求心性出力と神経終末標識の複合記録

解剖

されたマウス耳介または外耳から始めて、接続された神経を露出させます。

記録する神経を記録電極に挿入します。

耳介縁付近の脂肪層を取り除いて毛包基部を露出させ、皮膚を折りたたんで毛髪を露出

させて刺激します。

機械的刺激プローブを配置して、毛髪に触れてそらします。

この刺激により、感覚神経終末が活性化され、機械的にゲートされたイオンチャネルが開き、正のイオン流入が可能になり、活動電位が生成されます。

活動電位は、これらの終末を通って記録されている神経に伝播します。信号を視覚化します。

次に蛍光染料を加え、髪の毛への刺激を続けます。

色素は刺激された神経膜に結合し、神経活動に影響を与えることなくエンドサイトーシスを介して内在化されます。

刺激後、結合していない染料を除去するために洗浄します。

隔離

剤を加えて、内在化していない膜結合色素を除去します。

蛍光顕微鏡を使用して、毛包の染色を視覚化し、機械的に刺激された神経終末を特定します。

刺激誘発活動電位を制御して記録するには、セラミック圧電アクチュエーターに取り付けられた火で研磨された10センチメートルのホウケイ酸微小電極ガラスの機械式プローブを使用します。プローブが皮膚のひだと平行に移動し、皮膚ではなく毛髪に接触するようにプローブを配置します。皮膚表面から約2分の1〜1ミリメートル上に置きます。次に、プローブが動いたときの音声出力を聞き取って、刺激を手動で検証します。

次に、毛髪の小さな領域に機械的刺激を駆動するようにソフトウェアをセットアップします。たとえば、10秒ごとに5ヘルツの正弦波で3秒間の刺激をプログラムします。これには、200〜2000ミクロンのプローブ変位が必要です。次に、自動刺激を繰り返して、神経で記録された反応の一貫性を確認します。再現性のある結果が得られるはずです。

結果が一定であれば、繰り返し率を 30 秒ごとに下げます。詳細な手順は、テキストプロトコルに記載されています。機械感覚チャネルの特性を調査し、毛包の周りの機械感覚終末にラベルを付けるには、10マイクロモルのFM143を溶液に加え、振動プローブで毛髪を刺激し続けながら60分間放置します。

この色素は、培養中の感覚ニューロンおよび蝸牛有毛細胞の候補トランスデューサーチャネルをブロックします。ただし、成熟した毛包求心性神経の発火をその場でブロックすることはありません。末端のラベルは、色素が末端として機能し、色素曝露中ずっと機械的刺激に反応し続けることを示しています。