ショウジョウバエの感覚ニューロンからの生理応答の検出

麻酔をかけた遺伝子組み換えショウジョウバエメラノガスターをカバーガラスに横向きに取り付けます。

前足を伸ばして固定し、足根骨部分を露出させます。

これらのセグメントは、カルシウム結合型で蛍光を発するカルシウム指示複合体を発現する味覚ニューロンを有する。

溶液を保持するために、ハエの周りに疎水性バリアを描きます。

ハエが回復するのを待ち、露出した足根骨セグメントに緩衝生理食塩水を重ねて

共焦点顕微鏡下で、足根筋セグメントを観察し、さまざまな深さで味覚ニューロンを画像化して、刺激前の蛍光を取得します。

油性リガンドを含む刺激溶液をセグメント上に追加します。

これらのリガンドは味覚ニューロン受容体に結合し、シグナル伝達経路を開始し、カルシウムチャネルの開放を引き起こします。

これにより、細胞外液からのカルシウムイオンが細胞質に入り、カルシウム指示複合体に結合し、蛍光発出が起こります。

再度観察すると、ニューロンの蛍光の増加は、リガンドに対するニューロンの生理学的応答を確認します。

ハエを麻酔した後、ごく少量の透明なマニキュアを使用して、0.17 ミリメートルのカバーガラスに取り付けます。ドロップ全体を使用して、フライの側面をスライドに取り付けます。次に、解剖顕微鏡の下で、濡れた絵筆を使用してハエの前脚を伸ばします。次に、2本の非常に薄いテープを使用して、1番目と5番目の足根骨セグメントをカバーガラスに固定します。

テングのニューロンを画像化する場合は、テングの吻の上に別の薄いテープを貼って、唇状を露出させます。次に、PAPペンを使用してフライの周りに短い壁を作ります。測定を行う前に、麻酔を30分間解除します。このプロトコルでは、PBSTを使用して1ミリリットルあたり1ミリグラムのストックリガンド溶液の必要な希釈液を調製します。

手順を開始するには、10マイクロリットルのPBSTを固定および露出した足根骨セグメントに重ねます。これにより脚が湿り、焦点が合わなくなるのを防ぎます。次に、sCMOSカメラを搭載したスピニングディスク共焦点顕微鏡など、高速時間分解能で良好な蛍光シグナルを達成できる光学系を使用してセグメントに焦点を当てます。足根骨セグメントで関心のあるニューロンの刺激前のZスタックを3つ収集します。

この例では、画像は 200 ミリ秒の露光と、2 秒ごとに 6 ミクロン x 1/2 ミクロンのセクションで 2 x 2 のビニングでキャプチャされます。レーザーの出力を最適化して、高い信号対雑音比を許容しながら、光退色を最小限に抑えてください。ここでは、491ナノメートル、100ミリワットのレーザーが30%の透過率で動作します。

は刺激前に検出可能でなければなりませんが、飽和に近づいてはなりません。次に、10マイクロリットルの刺激溶液を目的の足根骨セグメントにピペットで移します。ピペッティング中は、足やハエの体に触れないように細心の注意を払ってください。次に、最初の刺激後画像をすぐに取得し、蛍光の最大変化を記録するのに十分な画像を収集し続けます。