二重染色による小脳ニューロン培養におけるニューロン生存率の評価

グリア細胞の増殖を阻害する有糸分裂防止剤で処理された培養プレートから始めて、主に小脳顆粒ニューロンと少数のグリア細胞を残します。

培地を取り出し、冷たいリン酸緩衝生理食塩水またはPBSをゆっくりと加えて、細胞の生存率を維持します。

バッファーをコールド染色混合物と交換し、インキュベートします。

この混合物には、非蛍光化合物であるフルオレセインジアセチン(FDA)と、膜不透過性蛍光色素であるヨウ化プロピジウム(PI)が含まれています。

FDAは細胞内に拡散し、生細胞内の機能的なエステラーゼがそれを緑色の蛍光化合物に変換します。

PIは損傷した膜を通って死細胞に入り、DNAに結合し、赤色蛍光を発します。

染色液を取り除き、細胞の乾燥を防ぐために冷たいPBSを加えます。

FDAおよびPI染色の蛍光画像と位相差画像を取得します。FDA と PI の画像をマージします。

次に、この蛍光画像を位相差画像と比較すると、大きなグリア細胞を除外するのに役立ちます。

赤色蛍光はニューロンの死を示し、緑色の蛍光はニューロンの生存率を示します。

フル

オレセインジアセチン酸を10ミリリットルあたり10マイクログラムの最終濃度に、ヨウ化プロピジウムを10ミリリットルのPBSに最終濃度50マイクログラム/ミリリットルに混合することから染色を開始します。FDA PI溶液をボルテックスして混合し、氷の上に置きます。培養プレートを氷の上に置きます。

ピペットチップで細胞に触れずに、培地を慎重に吸引します。次に、冷たいPBSをゆっくりと加えます。PBSを吸引し、冷たいFDA PIまたはFDA PI Hoechst作業溶液を加えます。プレートを氷の上に5分間置きます。次に、FDA PIまたはFDA PI Hoechst作業溶液を吸引した後、各ウェルにコールドPBSを追加します。

蛍光顕微鏡が正しく設定されていることを確認してください。100〜300ミリ秒の露光時間と2.8倍のアナログゲインを使用して、それぞれ520、620、および460ナノメートルでのFDA PIとHoechstの蛍光放射を検出します。蛍光画像を採取した後、位相差モードを使用して通常の光の下で画像を撮影します。

FDA PI二重染色の場合は、グラフィック編集ソフトウェアでFDA陽性層をPI陽性層の上にドラッグして、細胞の画像をオーバーレイします。[レイヤー] パネルの不透明度フィールドに 50% を入力して、FDA 陽性レイヤーの不透明度を調整します。[レイヤー] メニューを開き、[表示をマージ] ボタンをクリックして、2 つのレイヤーをマージします。[画像]、[調整]、[明るさ/コントラスト]のコントラストフィールドに50を入力して、重ね合わせた画像のコントラストを設定します。オーバーレイ画像にFDAおよびPIの二重陽性細胞がないことを確認します。

FDA PI Hoechstトリプル染色の場合、再び、FDA陽性層をPI陽性層にドラッグし、FDA陽性層の不透明度を調整し、以前と同様に画像をマージして、細胞の画像をオーバーレイします。次に、結合されたレイヤー上の Hoechst ポジティブ レイヤーをドラッグします。

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レイヤー] パネルの不透明度フィールドに 50% を入力して Hoechst ポジティブ レイヤーの不透明度を調整し、[レイヤー] メニューを開いて [表示を結合] ボタンをクリックして 2 つのレイヤーを結合します。蛍光モードで撮影した画像と位相差モードで撮影した画像を比較することで、大きくて不規則なグリア細胞と小脳顆粒ニューロンを視覚的に区別します。