ヒト皮質脳切片におけるアミロイドβペプチドの可視化

アルツハイマー病患者から採取した脳組織の皮質スライスを含むスライドガラスを取ります。組織には、実質および大脳毛細血管内に不溶性アミロイドベータ沈着物が含まれています。

スライドを希釈アルコールに浸して、脂質と塩分を除去します。

無水アルコールで洗浄して組織を脱水し、固定剤を塗布して組織構造を維持します。

スライドを真空乾燥させ、水分を取り除きます。

加湿環境でギ酸蒸気で処理し、アミロイドベータ凝集体をより小さな可溶性ペプチドに分解します。

光学スキャナーを使用して、組織の構造的特徴の画像を生成し、イメージング質量分析からのデータを解釈します。

試験片の上にマトリックス溶液をスプレーします。

質量分析計を使用して、マトリックスが吸収するレーザーを照射してペプチドをイオン化します。次に、検出器は質量電荷比に基づいてそれらを識別します。

データを分析して画像を作成し、組織実質と脳毛細血管におけるアミロイドベータペプチドの分布を明らかにします。

組織切片をすすぐには、サンプルを40〜100ミリリットルの70%エタノールにガラス染色ジャーに30秒間浸漬し、内因性脂質と無機塩を除去します。テキストプロトコルにリストされている洗浄シーケンスを使用してサンプルを洗浄します。次に、サンプルを真空中で30分間乾燥させます。

次に、解剖脳組織からのアミロイドベータタンパク質のイオン化を改善するために、組織切片をギ酸蒸気で処理します。これを行うには、摂氏60度のオーブンと、5ミリリットルの100%ギ酸を入れたインキュベーションガラス皿を準備します。インキュベーションガラス皿内の空気湿度を飽和レベルに保ちます。

ギ

酸に浸さないようにしながら、組織スライドをインキュベーションガラス皿に入れ、6分間処理します。フィルムスキャナー、ゲルスキャナー、またはデジタル顕微鏡を使用してサンプルの光学画像を撮影します。このステップは室温で実行します。

サンプルの光学画像のアライメントは、サンプルターゲットが装置内に配置されるときに必要です。通常、マトリックス層の下の組織切片を認識することはできません。光学画像とサンプルを関連付けるには、光学画像とカメラ光学系のマトリックス層の下に見えるガイドマークを作成します。最も簡単な方法は、光学画像を撮影する前に、サンプルの周囲に少なくとも3つの補正液マークを見つけることです。

超音波噴霧器でマトリックスを噴霧するには、噴霧する組織をデシケーターから取り出し、チャンバーに入れます。ティッシュがセンサーウィンドウを覆っていないことを確認してください。スタートボタンを押して準備を開始します。通常、準備時間は約90分です。

調製は、マトリックス層の厚さと湿潤度のモニタリングによって自動的に調整されます。あるいは、自動噴霧器で組織表面にマトリックス溶液を噴霧するには、毎分 10 PSI および 0.15 ミリリットルに設定された溶媒ポンプ システムを使用して、マトリックス溶液を供給します。

加熱されたシースガスの一定の流れは、マトリックス溶液スプレーと同時に供給されます。MALDI-IMSでハイスループット、高空間分解能のイメージング実験を行います。質量分析測定では、MALDI制御ソフトウェアとデータ解析ソフトウェアを使用して組織領域を定義します。

質量電荷比範囲が2,000〜20,000、空間分解能が20〜100ミクロンの正の線形モードでスペクトルを取得します。キャリブレーション標準物質を作るには、タンパク質キャリブレーション標準物質にペプチドキャリブレーション標準物質をCHCAとTA30溶液中で1対4の割合で溶解し、10倍に希釈します。

1マイクロリットルの校正標準物質をスライド上の4つの異なる場所に置きます。分子組織学ソフトウェアを使用して、複数の信号画像を重ね合わせて、動脈壁の老人性プラークに共局在するさまざまなアミロイド-ベータペプチドなど、さまざまな信号の空間的相関関係を見つけます。