シングルセルRT - PCR技術を用いて黒質神経細胞に電位依存性カリウムチャネルのmRNA発現のプロファイリング

本手順の全般的な目的は、個々のニューロンにおけるメッセンジャーRNAを検出することです。これは、パッチクランプ法を用いて個々のニューロンを記録し、その後、記録した各ニューロンから細胞質を完全に吸引することで達成されます。Mr.mRNAと細胞質からcDNAが作製され、PCRによって増幅されます。

最終的に、受容体、イオンチャネル、および酵素の特異的なmRNAは、従来のゲルイメージングシステムで検出できます。私はテネシー大学ヘルスサイエンスセンターで勤務しております。一般的に、この方法に不慣れな方は、単一のニューロンに含まれるmRNA量が極めて少なく、失われやすいため、苦労することがあります。

まず、バイブレーターを用いて、黒質の中前部を含む厚さ300 µmの脳冠状切片を作成します。脳は、生後15日から40日のSprague Dawleyラットから摘出してください。切片作成の手順は、95%酸素および5%二酸化炭素で酸素化し、pH 7.4に調整した高濃度スクロース切断溶液中で、氷冷状態で実施します。その後、5%二酸化炭素および95%酸素ガスをバブリングした人工脳脊髄液中で切片をインキュベートします。

温度を34°Cに維持し、スライスを45分間静置します。その後、記録を開始するまで脳スライスを室温で保持します。まず、脳スライス1枚をパッチクランプ記録チャンバーに移します。

32°Cの酸素供給済み人工脳脊髄液を用いて連続灌流を行います。DNAおよびRNAフリーの水で調製し、オートクレーブ滅菌した細胞内液をパッチピペットに充填します。溶液を満たしたピペットをバス内に降下させます。

抵抗値が2〜3 MΩの間であることを確認します。まず、解剖学的な特徴的な位置から黒質を特定します。次に、NAMAR光学系と60倍の対物レンズを用いて、記録用に黒質緻密部（SNC）および黒質網様部（SNR）から大きな細胞を選択します。

これらは間違いなくドーパミン作動性またはGABA作動性ニューロンであると考えられます。標準的なギガシール全細胞記録法を用いて、カレントクランプおよびボルテージクランプ測定を行ってください。mRNAの分解を最小限に抑えるため、これらの記録は通常5分以内に完了させる必要があります。

約1分間で、細胞膜およびスパイク特性のみを記録することにより、目的のニューロンの電気生理学的フィンガープリントを提供することが可能です。目的のニューロンからデータを取得した後、口による緩やかな吸引で細胞質を吸引します。この際、密閉（シール）が破れないように注意してください。

mRNAを含む細胞外デブリがパッチピペットに吸い込まれ、細胞内容物を汚染する可能性があります。ピペットチップを切断し、軽い正圧をかけることで、細胞内容物を0.2 milliliterのPCRチューブに排出します。終了後、mRNAを含む可能性のある細胞外デブリによる汚染を防ぐため、直ちにチューブを-20°Cのフリーザーに保管してください。

吸引を行わずに組織内に挿入したパッチピペットの内容物を回収し、陰性対照を作成します。10から20個のニューロンから細胞内容物を回収した後、直ちに逆転写反応を開始します。mRNAの分解を最小限に抑えるため、まずDNaseを用いて、25 °Cで5分間、混入したゲノムDNAを消化してください。

このステップは潜在的な偽陽性を減らすために極めて重要であり、省略してはいけません。次に、1.2 µLの25 mM EDTAを用いてDNAを不活化し、サンプルを70 °Cで5分間インキュベートします。その後、市販のキットを使用してCD NAを合成し、ゲノムDNAが完全に除去されたことを確認してください。

逆転写酵素を除いた各サンプルのコントロール反応を行います。この際、その他の反応成分はすべて同じ条件とします。生成物は、PCR設計で使用するまで-20°Cで保存してください。

GenBankの配列に基づいたプライマーを使用し、可能な限り、ゲノムDNAの混入を検出できるよう、イントロンをまたぐプライマー設計を行ってください。プライマーペアの有効性を確認するため、まずは全脳cDNAを用いてテストします。標準的なサーマルサイクリングプロトコルを用いて、30 µLのcDNAのうち5 µLを35サイクルPCR増幅させます。

第2段階では、第1段階のPCR産物1 µLを同一のプライマーを用いてPCR増幅し、わずかに変更したサイクリングプロファイルを使用します。次に、産物を2.5% AGROSゲルで分離し、EtBrまたはGelGreenを用いて可視化します。UVライトの下で陽性DNAバンドを切り出し、市販のキットを用いてシーケンシングを行い、DNAを回収します。

黒質緻密部および黒質網様部のニューロンにおける電気生理学的特性を比較した。SNR GABA作動性ニューロンは、約10 hertzのより高頻度な自発的スパイクを示した。これらのスパイクは、過分極電流注入時に約1 millisecondの基底持続時間を示した。

SNR GABA作動性ニューロンは、わずかなSAG反応を示し、弱く活性化された電流が認められました。対照的に、黒質ドーパミン作動性ニューロンは、基底持続時間が約3ミリ秒の低頻度自発スパイクを示しました。また、ドーパミン作動性ニューロンは過分極に対して顕著なSAGを示しましたが、これはSNR GABA作動性ニューロンにおいてIH電流が強く発現している一方で、ドーパミン作動性ニューロンではそうではないことを示しています。

シングルセルRT-PCRにより、GABA合成の鍵となる酵素であるグルタミン酸脱炭酸酵素1のmRNAが検出されました。対照的に、シングルセルRT-PCRにより、GABA作動性ニューロンではなく、特定されたSNCおよびSNRのドーパミン作動性ニューロンにおいて、ドーパミン合成の鍵となる酵素であるチロシン水酸化酵素のmRNAが検出されました。

次に、電圧依存性KV3チャネルサブユニットの発現をプロファイリングするために、シングルセルRT-PCRを用いました。これらのサブユニットは、電圧依存性カリウムチャネルの特性を変化させます。SNR gabaの例では、KV3.1、3.2、3.3、および3.4のニューロンmRNAが、あるSNRDAニューロンにおいてのみ検出されました。また、プールしたデータではKV3.2、3.3、および3.4が検出されました。

SNR GABA作動性ニューロンでは、黒質ドパミン作動性ニューロンよりもKV 3.1が高頻度で検出されており、これは高速発火するSNR GABAニューロンにおいてKV 3.1の発現レベルが高いことを示しています。この手順を行う際は、手袋を着用し、使用後の器具を汚染のない状態に保つことが重要です。この手法は、神経科学分野の研究者が神経系における受容体やイオンチャネルの発現および機能を探索するための道を切り拓きました。