シングルセルRT - PCR技術を用いて黒質神経細胞に電位依存性カリウムチャネルのmRNA発現のプロファイリング

この手順の全体的な目標は、個々のニューロンのメッセンジャーRNAを検出することです。これは、個々のニューロンをパッチクランプして記録し、Mr.mRNAと細胞質から記録された各ニューロンから細胞質を完全に吸引することによって達成されます。CD NAはPCRによって作られ、増幅されます。

最終的には、受容体、イオンチャネル、および酵素の特異的mRNAを、従来のゲルイメージングシステムを通じて検出できます。私の名前は、テネシー大学ヘルスサイエンスセンターで働いています。一般的に、この方法に不慣れな個人は、単一の神経内のMRIの量が非常に少なく、簡単に失われるため、苦労します。

このプロトコルは、バイブレーターを使用して、実質的な黒質の中央吻側部分を含む厚さ300マイクロメートルの冠状脳スライスを切断することから始めます。脳は、15〜40日齢のスプラドリーラットから分離できます。スライス切断手順は、95%の酸素と5%の二酸化炭素で酸素化された高ショ糖切断溶液で氷冷して行われ、pH 7.4で、スライスを人工脳脊髄液でインキュベートし、5%二酸化炭素、95%酸素ガスで泡立てます。

温度を摂氏34度に保ち、スライスを45分間そのままにしておきます。その後、脳のスライスを記録まで室温に保ちます。まず、1つの脳スライスをパッチクランプ記録チャンバーに移します。

酸素化人工脳脊髄液を摂氏32度で連続的に灌流します。パッチピペットに、DNAおよびRNA遊離水で調製したオートクレーブ細胞内溶液を充填します。ロードされたピペットをバスに下げます。

抵抗が2〜3メガオームであることを確認してください。まず、実質的な黒体をその明確で解剖学的な位置で見つけます。次に、namar光学系と60倍対物レンズを使用して、SNCとSNRで大きなセルを選択して記録します。

これらは、ためらうことなく可能なドーパミン作動性またはGABA作動性ニューロンです。従来のギガタイトシール全セル構成を使用して、電流クランプと電圧クランプを作成します。これらの記録は、mRNAの分解を最小限に抑えるために、通常5分以内に実行する必要があります。

約1分で、目的のニューロンの膜とスパイク特性のみを記録することにより、目的のニューロンに電気生理学的フィンガープリントを提供することができます。目的のニューロンからデータを取得した後、穏やかな口内吸引を使用して細胞質を吸引します。そうでなければ、タイトシールを壊さないでください。

mRNAを含む細胞外デブリがパッチピペットに吸い込まれ、細胞内容物を汚染する可能性があります。ピペットの先端を壊し、軽い陽圧を加えることにより、細胞内容物を0.2ミリリットルのPCRチューブに排出します。終了したら、すぐにチューブをネガティブ20フリーザーに入れて、mRNAを含む可能性のある細胞外破片の汚染を除外します。

吸引を使用せずに、組織に下げられたパッチピペットの内容物を収集することにより、ネガティブコントロールを作成します。10〜20個のニューロンから細胞内容物を収集した後、すぐに逆転写反応を開始します。mRNAの分解を最小限に抑えるには、まず、汚染物質のゲノムDNAをDNAで1回、摂氏25度で5分間消化します。

この手順は、潜在的な誤検知を減らすために重要であり、回避すべきではありません。次に、1.2マイクロリットルの25ミリモルEDTAでDNAを不活性化し、サンプルを摂氏70度で5分間インキュベートします。次に、市販のキットを使用してCD NAを合成し、ゲノムDNAが完全に除去されたことを確認します。

各サンプルのコントロール反応を逆転写酵素なしで実行します。他のすべての反応成分は同じままですが。PCR設計に必要になるまで、製品を摂氏マイナス20度で保管してください。

Genバンクの配列に応じたプライマーは、可能な限り、ゲノムDNA汚染を検出するために、プライム修復にまたがるTイントロを作成します。プライマーペアの有効性を確認するには、最初の段階で全脳CDNAでプライマーペアをテストします。PCRは、標準的なサーマルサイクリングプロトコルを使用して、30マイクロリットルのCDNAのうち5マイクロリットルを35サイクルで増幅します。

第 2 段階では、PCR は、同じプライム修復で 1 マイクロリットルの第 1 段階の PCR 産物を増幅し、わずかに変更されたサイクリングプロファイルを使用します。次に、2.5%AGROSゲル上で製品を分離し、AUMブロマイドまたはゲルグリーンを使用して視覚化します。UV光の下で、陽性のDNAバンドを切り取り、市販のキットを使用してDNAを収集するためにそれらを配列決定します。

黒体、pars、compacta、およびpars reticulataのニューロンの電気生理学的特性を比較しました。SNR GABA作動性ニューロンは、約10ヘルツでより高い周波数の自発的なスパイクを示しました。スパイクは、過分極電流注入時に約1ミリ秒の基本持続時間を持っていました。

SNR GABA作動性ニューロンは、毎週活性化された電流を示す微妙なSAG応答を示しました。対照的に、黒人ドーパミン作動性ニューロンは、基本持続時間が約3ミリ秒の低周波自発的スパイクを示しました。ドーパミン作動性ニューロンはまた、過分極に応答して顕著なSAGを示し、SNR GABA作動性ニューロンではIH電流が強く発現するが、ドーパミン作動性ニューロンでは発現しないことを示しました。

シングルセルR-T-P-C-Rは、GABA合成の重要な酵素であるグルタミン酸デカルボキシラーゼ1のmRNAを検出しました。対照的に、同定されたSNCおよびSNRドーパミン作動性ニューロンが、GABA作動性ニューロンでは同定されなかった。シングルセルR-T-P-C-Rは、ドーパミン合成の重要な酵素であるチロシンヒドロキシラーゼのmRNAを検出しました。

次に、シングルセルR-T-P-C-Rを使用して、電位依存性カリウムチャネルの特性を変化させる電圧活性化KV3チャネルサブユニットの発現をプロファイリングしました。SNR gabaの例では、KV 3.1、3.2、3.3、および3.4のニューロンmRNAが例のS-N-R-D-Aニューロンのみで検出されました。KV 3.2、3.3、3.4 がプールされたデータで検出されました。

KV 3.1は、黒人ドーパミン作動性ニューロンよりもSNR GABA作動性ニューロンでより頻繁に検出され、高速バイキングSNR GABAニューロンにおけるKV 3.1の発現レベルが高いことを示しています。この手順を試行する際には、手袋を着用し、開発後もツールを科学的な自由に保つことを忘れないでください。この技術は、神経科学の分野の研究者が神経系の受容体とイオンチャネルの発現と機能を探求する道を開きました。