ショウジョウバエの幼虫における高出力レーザーを用いた標的神経損傷の誘導

麻酔をかけたショウジョウバエの幼虫を、真空グリーススポットを含むスライドガラス上の油滴にヘッドアップして置きます。

カバーガラスを配置し、そっと押して幼虫に接触させます。

幼虫を調整して、蛍光タンパク質を発現する標的ニューロンを含む領域を露出させます。

スライドを2光子顕微鏡で固定します。

低出力レーザーを使用して損傷を最小限に抑え、幼虫をスキャンして蛍光標的ニューロンのある領域を特定します。

次に、スキャン ウィンドウを調整して、ニューロン投影の一種である軸索を含むターゲット領域に焦点を合わせます。

次に、スキャン速度を下げ、レーザー出力を上げます。

高出力レーザーは標的の軸索に当たり、局所的な熱を発生させて軸索に損傷を与え、損傷部位の周囲の蛍光を高めます。

最後に、低出力レーザーモードに戻します。損傷部位に小さなクレーターのリング状構造が存在することは、神経損傷の成功を確認します。

幼虫の麻酔から始めます。ヒュームフードに、60 ミリメートルのガラス皿を 15 センチメートルのプラスチック製ペトリ皿に入れます。次に、ティッシュペーパーを折り、ガラス皿に入れます。ジエチルエーテルを加えた後、グレープ寒天プレートを組織の上に置きます。次に、スライドガラスの上に、中央にハロカーボン 27 オイルを 1 滴垂らし、四隅のそれぞれに真空グリースを塗ります。

次に、鉗子を使用して幼虫1匹を寒天プレートに移し、ガラス皿に蓋をして幼虫を麻酔します。幼虫が動きを止めたらすぐに、頭を直立させて慎重にハロカーボンオイルに移します。次に、スライドの上にカバーガラスを置き、幼虫に触れるまでそっと押し下げます。次に、穏やかな力でカバーガラスをスライドさせ、2 光子レーザーが最も当たる場所までアブレーションするセルを転がします。場所は、標的にされているニューロンによって異なります。

次に、2光子顕微鏡ステージでアセンブリを固定し、40倍の油浸対物レンズを使用して目的のセルに焦点を合わせます。ソフトウェアで、スキャンモードに切り替え、保存したプロトコルをロードします。ピンホールが完全に開いていることを確認してください。次に、ライブモードで、関心のある領域の適切な画像を取得します。次に、ライブスキャンを停止して、[切り抜き]ボタンが使用可能になるようにします。クロップ機能を使用して、スキャンウィンドウを調整して、ターゲット領域を損傷の可能性のある部位だけに焦点を合わせます。

次に、新しいイメージングウィンドウを開きます。次に、スキャン速度を下げ、レーザー強度を上げます。次に、連続ボタンを切り替えて、スキャンを開始および停止します。注意深く見てください。蛍光が急激に増加したらすぐにスキャンを終了します。次に、元のイメージングウィンドウに戻り、ライブモードを選択し、フォーカスを調整してターゲットにした領域を見つけます。

怪我が成功した良い兆候は、怪我の部位に小さなクレーター、リング状の構造、または局所的な破片が現れることです。レーザー出力が高すぎると、大きなダメージ領域が見え、致命的になる可能性があります。