JoVE 実験百科事典
神経科学
0 回視聴 • 3:14 分 • July 8th, 2025
マウス脳幹の両側に位置する青斑核領域には、ノルエピネフリン産生ニューロンが含まれており、脳全体のさまざまな領域を調節しています。
これらの青斑核領域を検出するには、固定された凍結保存されたマウス脳幹切片を運ぶスライドガラスから始めます。
スライドをバッファーで洗浄し、固定トレースを除去します。
界面活性剤を含むバッファーを加え、インキュベートしてメンブレンを透過処理し、洗浄します。
ドーパミンを神経伝達物質であるノルエピネフリンに変換するドーパミンβ-ヒドロキシラーゼ酵素に特異的な一次抗体を導入します。
抗体がドーパミンβ-ヒドロキシラーゼと相互作用するようにインキュベートします。
結合していない抗体を洗浄して除去します。
次に、緑色の蛍光色素共役二次抗体を加え、暗所でインキュベートします。
二次抗体は一次抗体に結合し、洗浄します。
脳セクションに封入剤を加え、蓋をして乾燥させます。
蛍光顕微鏡でスライドを観察します。
脳切片の標識ノルエピネフリン産生ニューロンを表す緑色の蛍光は、青斑核領域の存在を示しています。
初日に、24ウェルプレート内の脳スライスをPBSでそれぞれ5分間3回洗浄します。その後、0.5%PBSを洗剤で加え、摂氏4度で24時間透過処理します。
翌日、スライスを0.5%PBSDでそれぞれ5分間3回洗浄します。次に、一次抗体を0.5%PBSDに1〜500の希釈で添加し、摂氏4度で18時間インキュベートします。
3日目に、スライスを0.5%PBSDでそれぞれ10分間3回洗浄します。次に、二次抗体を1〜1,000の希釈で0.5%PBSDに添加します。プレートをアルミホイルで包み、摂氏4度で16時間インキュベートします。
インキュベーション後、スライスを0.5%PBSDでそれぞれ5分間3回洗浄し、次にPBSで5分間洗浄します。DAPIを含まないハードセットの封入剤を使用してセクションを覆います。ガラスカバーをかぶせ、室温で30分間乾燥させます。次に、適切な蛍光波長からのシグナルを検出する設定を備えた共焦点顕微鏡を使用して、脳スライスを画像化します。