In vivo研究のための内側神経節隆起細胞のウイルス媒介標識と移植

遺伝子組み換えマウス胚から、皮質介在ニューロン前駆細胞を含む内側神経節隆起組織を採取します。

カチオン性ポリマーを加え、組織を単一細胞懸濁液に解離させます。

Lox部位に隣接するCreリコンビナーゼ依存性GFPレポーターを運ぶレンチウイルスベクターを追加します。インキュベート。

このポリマーはウイルスおよび宿主細胞膜の電荷を中和し、ウイルスの融合とRNA放出を可能にします。

ウイルスRNAは逆転写され、宿主ゲノムに組み込まれます。

遠心分離して上清を廃棄します。余分な媒体を吸収します。

細胞を疎水性表面に移し、注入装置にロードします。

麻酔をかけたマウスの子犬の皮質に細胞を注入します。

子犬が回復して成長するのを待ちます。

移植された前駆細胞は、皮質の成熟した介在ニューロンに分化します。

これらの介在ニューロンのサブグループは、CreリコンビナーゼとRFPを共発現します。

これらの介在ニューロンでは、Creはロックス部位を切除し、GFP遺伝子を反転させ、その発現を可能にします。

RFPとGFPの共発現を視覚化して、Creを発現する介在ニューロンを特定します。

レンチウイルスを調製し、書面によるプロトコルの指示に従って MGE を解剖した後、MGE の両方の半球を収集し、組織を 10% FBS を含む 500 マイクロリットルの DMEM を含む 2 つの 1.5 ミリリットルの収集チューブに入れます。

すべての組織が収集されるまで、サンプルを氷上に保管します。次に、チューブをBSL-2認定フードに移します。チューブの底に沈殿したMGE組織を乱すことなく、培地を慎重に吸引します。

次に、約500マイクロリットルの予熱したDMEMを10%FBS培地とともに加えます。ポリブレンを最終濃度8マイクログラム/ミリリットルまで添加し、単一細胞懸濁液が得られるまでP1000ピペットチップで滴定します。次に、15〜20マイクロリットルの濃縮レンチウイルスを各チューブに加えます。

次に、各チューブをしっかりと閉じ、反転させて混合し、すべてのチューブを摂氏37度のインキュベーターに入れます。細胞をレンチウイルスと少なくとも30分間インキュベートしますが、時間が長くなると細胞の生存率が低下するため、1時間以内にインキュベートします。10分ごとにチューブを反転させます。

インキュベーション後、インキュベーターからチューブを取り出し、摂氏4度で700倍gで3分間遠心分離して細胞をペレット化します。BSL-2フードで、上清を取り除き、10%漂白剤に捨てます。次に、10%FBSを含むDMEMを1ミリリットル加え、ペレットを2〜3回滴定して洗浄します。

以前と同様に遠心分離した後、この洗浄ステップをさらに2〜3回繰り返して、余分なウイルスを除去します。最終洗浄後、できるだけ多くの媒体を取り除き、各チューブを氷の上に置きます。

チューブの側面に残留培地があるため、移植手順が開始されるまでに、約2〜3マイクロリットルの培地が細胞ペレットを覆うことになります。滅菌技術が全体を通して使用されていることを確認しながら、鉱物油を1ミリリットルの注射器に吸い込み、次に30.5ゲージの針でガラスピペットに鉱物油を完全に充填します。

次に、ガラスピペットを定位固定装置に取り付け、プランジャーにロードします。油圧駆動装置を使用するアシスタントと一緒に、プランジャーをガラスピペットの半分ほど動かし、こぼれた鉱物油を清潔なペーパータオルで取り除きます。

次に、滅菌ペーパータオルの角を細かくねじり、これを使用してMGE細胞ペレットの上の余分な培地を繊細に除去します。これにより、セル密度が集中し、より少ない注入量を達成できます。

次に、P2ピペットを使用して細胞ペレットをゆっくりと引き上げ、疎水性表面に分注する前に1〜2回滴定します。容量は1マイクロリットル弱でなければなりません。

針の先端を細胞懸濁液に動かし、油圧駆動装置を使用して、細胞懸濁液をピペットに引き上げます。低体温療法で子犬を麻酔した後、鉗子でつま先の間の皮膚をつまんで麻酔の有効性を確認します。反応は見られないはずです。

次に、子犬を注射装置の下にある型に置き、頭の皮膚を引き戻し、標準的な実験用テープで固定して皮膚をぴんと張らせます。素早く作業し、定位固定腕を操作して、ガラスピペットの先端を子犬の頭の表面に垂直に配置します。

ピペットがヘッドに接触している場合は、これをゼロと見なします。次に、ピペットを皮膚と頭蓋骨の表面から皮質に押し込みます。次に、ピペットを2回挿入および引き込みてから停止します。

細胞を新皮質に標的とするために、マイクロピペットが0.1ミリメートルの深さにあるときに注射が行われます。針が所定の位置に配置されたら、油圧装置を回転させてプランジャーをガラスピペットに進め、部位ごとに50〜70ナノリットルを注入します。

新皮質全体に形質転換された細胞を広く分布させる必要がある場合は、異なる吻側尾部レベルの3〜6つの異なる部位でこの手順を繰り返します。注射が完了したら、子犬をステージから取り外し、承認された手順に従ってマークを付けます。

子犬が回復し、自分で動けるようになったら、授乳中のメスと残りの子と一緒に元に戻します。処置後と翌日に子犬をチェックし、健康状態が悪化する兆候がないことを確認します。