In vivo研究のための内側神経節隆起細胞のウイルス媒介標識と移植

遺伝子組み換えマウス胚から、皮質介在ニューロン前駆細胞を含む内側神経節隆起組織を採取します。

カチオン性ポリマーを加え、組織を単一細胞懸濁液に解離させます。

Lox部位に隣接するCreリコンビナーゼ依存性GFPレポーターを運ぶレンチウイルスベクターを追加します。インキュベート。

このポリマーはウイルスおよび宿主細胞膜の電荷を中和し、ウイルスの融合とRNA放出を可能にします。

ウイルスRNAは逆転写され、宿主ゲノムに組み込まれます。

遠心分離して上清を廃棄します。余分な媒体を吸収します。

細胞を疎水性表面に移し、注入装置にロードします。

麻酔をかけたマウスの子犬の皮質に細胞を注入します。

子犬が回復して成長するのを待ちます。

移植された前駆細胞は、皮質の成熟した介在ニューロンに分化します。

これらの介在ニューロンのサブグループは、CreリコンビナーゼとRFPを共発現します。

これらの介在ニューロンでは、Creはロックス部位を切除し、GFP遺伝子を反転させ、その発現を可能にします。

RFPとGFPの共発現を視覚化して、Creを発現する介在ニューロンを特定します。

レンチウイルスを調製し、書面によるプロトコルの指示に従って MGE を解剖した後、MGE の両方の半球を収集し、組織を 10% FBS を含む 500 マイクロリットルの DMEM を含む 2 つの 1.5 ミリリットルの収集チューブに入れます。

すべての組織が収集されるまで、サンプルを氷上に保管します。次に、チューブをBSL-2認定フードに移します。チューブの底に沈殿したMGE組織を乱すことなく、培地を慎重に吸引します。

次に、約500マイクロリットルの予熱したDMEMを10%FBS培地とともに加えます。ポリブレンを最終濃度8マイクログラム/ミリリットルまで添加し、単一細胞懸濁液が得られるまでP1000ピペットチップで滴定します。次に、15〜20マイクロリットルの濃縮レンチウイルスを各チューブに加えます。

次に、各チューブをしっかりと閉じ、反転させて混合し、すべてのチューブを摂氏37度のインキュベーターに入れます。細胞をレンチウイルスと少なくとも30分間インキュベートしますが、時間が長くなると細胞の生存率が低下するため、1時間以内にインキュベートします。10分ごとにチューブを反転させます。

インキュベーション後、インキュベーターからチューブを取り出し、摂氏4度で700倍gで3分間遠心分離して細胞をペレット化します。BSL-2フードで、上清を取り除き、10%漂白剤に捨てます。次に、10%FBSを含むDMEMを1ミリリットル加え、ペレットを2〜3回滴定して洗浄します。

以前と同様に遠心分離した後、この洗浄ステップをさらに2〜3回繰り返して、余分なウイルスを除去します。最終洗浄後、できるだけ多くの媒体を取り