JoVE 実験百科事典
神経科学
0 回視聴 • 4:11 分 • July 8th, 2025
対照と変異ショウジョウバエの幼虫を、グルコースフリーバッファーを含む別々の皿に入れます。
幼虫を解剖して内臓を取り除き、中枢神経系またはCNSを露出させます。
CNSには、運動ニューロンを保有する腹側神経索が含まれています。変異幼虫では、これらのニューロンはアップレギュレートされたグルコース代謝を示します。
両方のグループの運動ニューロンは、ドナーおよびアクセプター蛍光色素を含む細胞内グルコースセンサーを発現します。
幼虫を共焦点顕微鏡下に置きます。励起されると、ドナー蛍光色素は蛍光を発します。
この蛍光を使用して運動ニューロンを見つけます。
バッファーをグルコースを補給した溶液に交換します。
グルコースはニューロンに入り、センサーに結合し、2つの蛍光色素を近づけるコンフォメーション変化を引き起こします。
励起されると、アクセプターは、蛍光共鳴エネルギー移動またはFRETと呼ばれるドナーから放出されるエネルギーを吸収し、蛍光を放出します。
FRETシグナルはグルコース取り込みと相関しています。対照と比較して変異幼虫のアクセプターシグナル強度が高い場合は、グルコース代謝がアップレギュレートされていることを示しています。
解剖を開始する前に、イメージング顕微鏡とレーザーの電源を入れます。次に、さまよう3齢の幼虫を集めます。二重蒸留水ですすぎ、事前に準備したエラストマーで裏打ちされた皿上のHL3バッファーの一滴に入れます。
次に、解剖顕微鏡下で、鉗子のペアを使用して、幼虫を昆虫ピンで慎重に縦に伸ばして、幼虫の前端と後端を背側を上にしてピンで留めます。角度の付いた虹彩はさみを使用して、後部ピンのすぐ上を切開します。次に、切開部から幼虫の前端に向かって垂直に切り込みを入れます。
HL3バッファーを数滴加えた後、必要に応じて、中枢神経系を乱すことなく、気管と残りの浮遊器官を除去します。次に、フラップをピンで留めて体壁を伸ばし、神経筋系を無傷に保ちながら中枢神経系を露出させます。
画像取得には、40倍の水浸レンズを備えた正立共焦点顕微鏡を使用します。次に、405ナノメートルのレーザーを選択してCFPを励起します。次に、スキャン速度、平均、対物レンズ、ズームピンホールサイズ、空間分解能などの取得パラメータを最適化します。信号が最適なダイナミックレンジになるようにゲインを調整し、すべての遺伝子型に同じパラメータを使用します。
腹側神経索内の運動ニューロンを画像化するには、解剖されたサンプルの入ったシリコン皿をレンズの下に置き、トレハローススクロースHL3と接触するようにレンズを下げます。レンズがバッファーに完全に浸っていることを確認し、必要に応じてバッファーを追加します。
次に、CFPおよびFRETチャネルを使用して、腹側神経索正中線に沿って位置する、焦点が合った少なくとも6つの運動ニューロンで構成される光学選択を手動で選択します。その後、10秒または10分ごとに画像を取得します。これらの画像はベースラインを表します。
グルコース刺激のために、パスツールピペットを使用してHL3バッファーを含むトレハローススクロースを除去し、腹側神経索を動かさずに5ミリモルグルコースを添加したHL3バッファーを追加します。その後、さらに10分間、10秒ごとに画像を取得します。
これらの画像は刺激段階を表しています。画像をドットcziファイル、またはイメージングソフトウェアがサポートする任意のファイルタイプとして、日付、遺伝的背景、実験条件、使用チャンネルなどのファイル名で保存します。パラメータを再利用して、すべての遺伝子型を画像化しました。