Name: アコースティックMicrostreamingを使用して標準的な実験系逆転写反応でmRNAの単セルの物理量からcDNA収量を増加させる (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 52 s
Description: 学ぶ アコースティックマイクロストリーミングを用いたマイクロミキサーによる単細胞mRNAからのcDNA収量増加法。標準的な逆転写反応で遺伝子発現解析の精度向上を実現する革新的なバイオテクノロジー技術です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

この研究はオーストラリアの国立保健医療研究評議会（プロジェクトの助成金がない。6288480）とスコビーとクレアマッキノントラストによってサポートされていました。

1。 RT反応をマイクロミキシング<ol><li>マイクロミキシングを持つRT反応を行う前に、RT反応の所望の温度にマイクロミキサーを平衡化します。 <ol><li> 37内部のマイクロミキサーを置く° C（またはRTの供給業者が推奨する温度）RT反応の開始前に少なくとも1時間のためのインキュベーター。 </li></ol></li><li>入力のトータルRNA（例えば0.1-1pg/μl）、代わりにNG -μgの単一セルの金額を使用することを除いて、逆転写酵素の供給業者の（Promega社から例えばMMTV - RT、キアゲンからOmniscript）の指示にしたがってRTミックスを、設定するサプライヤーが推奨する量。 <ol><li>我々は標準的な滅菌ヌクレアーゼフリー200μL薄壁PCRチューブを使用してください。 </li></ol></li><li>彼らはミキシングの準備ができているとすぐに安全にマイクロミキサーに位置RTチューブ。マイクロミキサーは、RT反応の間、37℃のインキュベーターの内部に残るはず。 </li><li>マイクロミキシングの適切な周波数と振幅を選択します。この例では150Hzの使用。 </li><li>のマイクロミキサーを切り替えて、RT反応（60分）期間中、常にそれを残す。 </li><li>マイクロミキサーのスイッチをオフにし、RT反応が完了すると、RTのチューブを取り出します。 </li><li>氷上でRTのチューブをセットし、そのような定量的ポリメラーゼ連鎖反応（定量PCRまたはリアルタイムPCR）として、さらにアプリケーションで通常どおり進みます。 </li></ol> 2。代表的な結果： RT反応のコンテキスト内でマイクロミキシングの利点は、他の混合方法（例えば、揺れボルテックスまたは粉砕）が使用されている場合に相対的cDNAの収量の増加です。これは、cDNAを用いて定量的ポリメラーゼ連鎖反応（定量PCRまたはリアルタイムPCR）のその後の分析により、例えば、見ることができます。図2Aは、直前のRTのインキュベーション（黒、"粉砕"にRT反応の粉砕に比べて最初の5分（青、"micromixed5"）または全体の60分間マイクロミキシングの効果（赤、"micromixed60"）を示しています）。この場合、前述のRT反応液量は25μlのであり、それはトータルRNAの2.5pg含まれている。 cDNAを表すNurr - 1 mRNAを検出するように設計されたプライマーを用いて定量PCRのトレースは、上記の表示され、平均値±この同じ実験の3反復で50％の最大蛍光に達するまでのサイクル数のSEMのは、以下にプロットされます。アスタリスクは、統計学的有意差（Tukeyの多重比較で、一方向ANOVA）を表します。粉砕に比べて大きな改善をもたらした前述のRT反応の最初の5分間マイクロミキシングは、前述のRT反応の全体の60分間マイクロミキシングのに対し、粉砕を介して非有意な改善をもたらしたことに注意すること、の大きさは約15定量PCRと同等であったサイクル、平均で。 マイクロミキシングのメリットも得、その後の定量PCR産物の融解曲線分析で見ることができます。図2Bに示す実験では、前述のRT反応の全体の60分間マイクロミキシングにのみ生産された最初の5分または粉砕のために一貫性のない定量PCRをマイクロミキシングのに対し、重複して試料中の一貫性のある定量PCRのシグナル（図2BA、2赤のトレース）となりましたトレース（図2BA、2青色のトレースと2本の黒い痕跡、それぞれ）。グレーのトレースは、定量PCRの反応から除外されたcDNAをしたネガティブコントロール（"NEG。"）です。この実験から、定量PCRの製品が（すなわち融解曲線分析）、その温度をランプによって変性されたそれは、適切なPCR産物（すなわち、mRNAのはるかに高い濃度が逆転写と定量PCRによって増幅された際に得られたものと同一であったアンプリコン、ことは明らかでしたデータは示されていないが）のみ60分（図2BB、2赤のトレース）のためにmicromixedされていた以下のRT反応存在していた。他のすべて（すなわちmicromixed5、粉砕およびネガティブコントロール）（例えばプライマーダイマー）の代替アンプリコンの製品を生成した。 <img src="/files/ftp_upload/3144/3144fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1標準的な実験RT反応へのマイクロミキシングを適用するためのプロトコルのフロー図。物理的原理に関与、マイクロミキサーとどのように社内のマイクロミキサーを構築するためのより詳しい説明を参照13,14に記載されています<img src="/files/ftp_upload/3144/3144fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。そうでなければ標準的な実験RT反応でmRNAの単一セルの量を構成するRT反応の前に適用されるマイクロミキシングのメリットを示す代表的な定量PCRデータ。Nurr - 1遺伝子をコードするcDNA表すmRNAを検出する定量PCRのトレースの例。前述のRT反応は、25μlの体積のトータルRNAの2.5pg含有し、℃で60分間、37℃インキュベーター中で行った。 RT反応は、Rの粉砕によって混合し、Tは、インキュベーション（黒痕跡、"粉砕"）する前に混ぜてRT反応の最初の5分間の間にmicromixed（青トレース、"micromixed5"）またはRT反応（赤いトレース、"micromixed60"の全体の60分間micromixed ）。平均±最大蛍光50％に達するために必要な定量PCRのサイクル数のSEMのは、この実験のn = 3の繰り返しのために以下にプロットされます。アスタリスクは有意差（Tukeyの多重比較を一元配置ANOVA）を示します。Bは Nurr - 1のcDNA産物、25μlの体積で、 ​​トータルRNAの25pgを含むRT反応は、次のこの時間を調べるもう一つの定量PCR実験。定量PCRのトレース（）と同様に得られる定量PCR産物の融解曲線解析は（b）の異なる混合条件として使用されています。ないcDNAは前述のRT反応に含まれていないれたネガティブコントロールも（灰色の痕跡、"NEG。"）が含まれています。 mRNAのはるかに高い濃度でRT反応も行うと（b）micromixed60用（赤のトレース）の試料のものと同一の融解曲線のピークを（データは示さず）を製造した。

<ol><li>Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+Funct+Genomic+Proteomic%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Brief Funct Genomic Proteomic.</a> 2 (1), 31-31 (2003).</li>
<li>Aumann, T. D., Gantois, I., Egan, K. Exp Neurol. 213 (2), 419-419 (2008).</li>
<li>Ottino, J. M., Wiggins, S. Philos Transact A Math Phys Eng Sci. 362 (1818), 923-923 (2004).</li>
<li>Losey, M. W., Jackman, R. J., Firebaugh, S. L. J Microelectromech. Syst. 11, 709-709 (2002).</li>
<li>Bontoux, N., Dauphinot, L., Vitalis, T. Lab Chip. 8 (3), 443-443 (2008).</li>
<li>Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. Anal Chem. 78 (9), 3084-3084 (2006).</li>
<li>Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. Anal Chem. 78 (3), 956-956 (2006).</li>
<li>Warren, L., Bryder, D., Weissman, I. L. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (47), 17807-17807 (2006).</li>
<li>Jiao, Z. J., Huang, X. Y. Microfluidics Nanofluidics. 6, 847-847 (2009).</li>
<li>Ahmed, D., Xiaole, M., Juluri, B. K. Microfluidics Nanofluidics. 7, 727-727 (2009).</li>
<li>Paxton, W. F., O'Hara, M. J., Peper, S. M. Anal Chem. 80, 4070-4070 (2008).</li>
<li>Autom, L. ab 11, 399-399 (2006).</li>
<li>Petkovic-Duran, K., Manasseh, R., Zhu, Y. 47 (4), 827-827 (2009).</li>
<li>Boon, W. C., Petkovic-Duran, K., White, K. 50 (2), 116-116 (2011).</li>
<li>Liu, R. H., Lenigk, R., Druyor-Sanchez, R. L. Anal Chem. 75 (8), 1911-1911 (1911).</li>
<li>Riley, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ann+Rev+Fluid+Mech%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Ann Rev Fluid Mech.</a> 33, 43-43 (2001).</li>
<li>Whitehill, J., Neild, A., Ng, T. W. Applied Physics Letters. 96 (5), 053501-053501 (2010).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もない。

ここで説明する標準的な実験RT反応にマイクロミキシングのアプリケーションの方法は、もちろん、どのような方法（例えば、細胞溶解、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション）を経由して収穫されたmRNAを含むことができる。また、任意のブランドまたはRT試薬、任意の温度（マイクロミキサーの材料の許容範囲内）の種類、および任意の期間を含むことができる。例えば、我々は、ランダムヘキサマーまたはオリゴdTプライマーを構成するRT反応から改善されたcDNA収量を観察している。それは次の制約に適合する他の生化学的変換（例えば、DNAのハイブリダイゼーション15）にも適用される場合があります。現在の技術の主な制約は、反応が湾曲した液体 - 空気界面（例えばメニスカス）を形成するソリューションの小さな（マイクロリットル）ドロップ内で発生する必要があります。我々は日常的に、それぞれ、4.7以上6.9ミリメートルの曲率半径で半月板を生産する、200μL薄壁PCRチューブに10または25μlのボリュームを使用してください。これにより、異なるソリューション間のインタフェースを延長し、短いタイムスケール上の場所を取る拡散をできるドロップで設定す...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td>トータルRNAは、スナップ凍結急性準備成体マウスの脳スライスから単離された</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PicoPure RNAアイソレーションキット</td><td>アークトゥルス、CA、アメリカ合衆国</td><td> KIT0204 </td><td>キットは現在、アプライドバイオシステムズから入手できます。 </td></tr><tr><td> DNA -フリーDNase処理と除去試薬</td><td>アンビオン</td><td> AM1906M </td><td></td></tr><tr><td>ランダムヘキサマープライマー</td><td>プロメガ</td><td> C1181 </td><td></td></tr><tr><td> AMV - RT </td><td>プロメガ</td><td> M5101 </td><td></td></tr><tr><td> dNTPのセット</td><td>プロメガ</td><td> U1240 </td><td></td></tr><tr><td> RNasin リボヌクレアーゼ阻害剤</td><td>プロメガ</td><td> N2111 </td><td></td></tr><tr><td> Nuclease - Free Waterを</td><td>プロメガ</td><td> P1193 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR グリーンPCRマスターミックス</td><td>アプライドバイオシステム</td><td> 4309155 </td><td></td></tr><tr><td> HPRT前進（20mer）：CTT TGC TGA CCT GCT GGA TT </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> HPRTリバース（20mer）：TAT GTC CCC CGT TGA CTG AT </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nurr1フォワード（23mer）：CAG CTC CGA TTT CTT AAC TCC AG </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nurr1リバース（23mer）：GGT GAG GTC CAT GCT AAA CTT GA </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>光度計1000分光光度計。 </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>コルベットローター遺伝子のRG - 6000 </td><td>コルベットライフサイエンス</td><td></td><td>コルベットライフサイエンスは、2008年7月にQIAGENに買収された</td></tr></tbody></table>

アコースティックmicrostreamingを使用して標準的な実験系逆転写反応でmrnaの単セルの物理量からcdna収量を増加させる

Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming

細胞の挙動との相関遺伝子発現は、理想的には単一細胞レベルで行われます。それが転写を逆にすることができます前に、単セル（1-5 1 - 50pgのトータルRNAの％、または0.01 - 2.5pg mRNAは、セル1あたり）に存在する不安定なmRNAの少量がほとんど劣化するため、これは容易に達成されていません安定したcDNAコピーに。例えば、標準的な実験用試薬とハードウェアを使用して、遺伝子のわずかな数は、定性的にセル2ごとに評価することができます。 mRNAの単セルの量を構成する標準的な実験の逆転写酵素（RT）反応（マイクロリットルの量で、すなわち標準試薬）の効率を向上させる一つの方法は、それが低下する前にmRNAをcDNAに変換できるので、より迅速に試薬を混合することです。しかし、マイクロリットルスケールでの液体の流れが層流であるため、これは自明ではない、すなわち混合の現在利用​​可能なメソッド（、揺れボルテックスと粉砕つまりは）効果的に試薬を混合するために十分なカオス運動を生成するために失敗する。この問題を解決するために、マイクロスケールの混合技術は、3,4を使用する必要があります。マイクロ流体ベースのミキシング技術の数が正常にRT反応の収量5-8を増加させるが開発されている。しかし、マイクロ流体技術は、比較的高価であり、まだ広く利用できない特殊なハードウェアを必要とする。安く、より便利なソリューションが望まれる。本研究の主な目的は、mRNAの単セルの量を構成する標準的な実験RT反応の小説&quot;マイクロミキシング&quot;技術の応用が著しく、そのcDNA収量を増加させる方法を説明することです。遺伝子発現の解析（2）より多くの定量;（1）セルごとに分析される遺伝子の大きい数と発現量の低い遺伝子の（3）良好な検出：我々は、cDNAの収量が可能な約10 100倍、増加見つける単一細胞インチマイクロミキシングは音響は、9-12小障害物の周りに伝播する音波が障害物の近くに平均流を作る現象をmicrostreamingに基づいています。我々は、主要な簡素化と音響microstreamingベースのデバイスを（&quot;マイクロミキサー&quot;）を開発しました。音響microstreamingは、システムが湾曲13の小さな半径を持つ液体-空気界面を持って確保することによってオーディオ周波数で達成することができます。チューブ内の溶液のマイクロリットルの容積のメニスカスの曲率の適切な小さい半径を提供します。オーディオ周波数の使用は、ハードウェアが安価と13の多彩なことができる、と彼らは標準的な実験室sonicatorsとすることができるように、核酸と他の生化学試薬が破損していないことを意味します。

我々は、そうでなければ標準的な実験の逆転写反応でmRNAの単一セルの量からcDNA収量を増加させるための新しい方法を説明します。目新しさは、ボルテ​​ックスまたは粉砕、揺れよりも効果的にマイクロリットルスケールでの流体を混合するために、音響microstreamingの現象を利​​用したマイクロミキサーの使用に存在する。

アコースティックMicrostreamingを使用して標準的な実験系逆転写反応でmRNAの単セルの物理量からcDNA収量を増加させる

遺伝子発現と細胞挙動の相関解析は、単一細胞レベルで行うことが理想的である。しかし、少量の…のため、これを容易に達成することはできない。

この手順では、単一細胞量のmRNAからCD NAの収量を増加させます。まず、マイクロミキサーを、目的の逆転写反応温度に設定したインキュベーター内で平衡化させてください。次に、マイクロリットル量の単一細胞RNAを含む、標準的なラボでのRT反応をセットアップします。反応チューブをミキシングホールにしっかりと固定し、適切なミキシングパラメータを選択してマイクロミキサーの電源を入れます。最終的に、この手順を逆転写（RT）反応の準備として用いることで、定量PCRによるcDNA収量を向上させることができます。マイクロミキサーを37 °Cのインキュベーター内で少なくとも1時間平衡化してください。標準的な滅菌済みヌクレアーゼフリーの200 µL薄壁PCRチューブを使用します。サプライヤーの指示に従って逆転写反応を準備しますが、入力する全RNAの量は単一細胞分としてください。次に、マイクロミキシングの適切な周波数と振幅を選択します。次に、チューブをマイクロミキサーにしっかりと固定します。その後、マイクロミキサーのスイッチを入れます。反応を60分間進行させ、完了後、マイクロミキサーのスイッチを切り、反応液を氷上に移して、直後のダウンストリームアプリケーションに使用します。他の方法と比較して、RT反応においてマイクロミキシングを用いる最大の利点は、cDNAの収量です。この定量PCR分析において、neuro 1 mRNAを標的とするcDNAを検出するように設計されたプライマーを用いたQPCRトレースにより、逆転写（RT）反応のインキュベーション直前の段階で、最初の5分間または60分間全体にわたってMicromミキシングを行った際の効果を、ミキシングなしの場合と比較して示しています。最初の5分間のMicromミキシングでは、顕著な改善は見られませんでした。しかし、60分間全体でMicromミキシングを行ったところ、QPCRのサイクル数にして15サイクル分に相当する、大幅な収量の向上が認められました。さらに、QPCRの融解曲線分析により、前述のR two反応の60分間全体にわたってマイクロミキシングを行った場合、赤色のトレースで示されるように、重複サンプルで一貫したシグナルが得られることが実証されました。これは、青色で示される最初の5分間のみマイクロミキシングを行った場合や、黒色で示される撹拌のみを行った場合に観察された変動のあるトレースとは対照的です。灰色のトレースはテンプレートコントロール（NTC）です。

increasing-cdna-yields-from-single-cell-quantities-mrna-standard

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

我々は、死後、人間の脳の上側頭回の層IIIの均質な細胞集団、錐体細胞からRNAを分離して抽出するためにレーザーキャプチャーマイクロダイセクションを使用してプロセスを説明します。私たちは、その後直線的に（T7ベース）mRNAを増幅し、Affymetrix社人間X3Pマイクロアレイにサンプルをハイブリダイズする。...

人間の死後の脳組織における単一細胞から、高品質のRNAを取得

ここでは、サンプルの限られた量を扱う場合は特に、マイクロRNA（miRNA）の発現レベルのコストと時間効果のハイスループットスクリーニングのツールと​​してのマイクロ流体プラットフォームとの組み合わせで最適化された多重逆転写定量PCR（定量RT -...

ハイスループットマイクロRNAプロファイリング：最適化されたマルチプレックスフリューダイナミックArrayTMのIFCSでナノリッタースケールでの定量RT - PCR

この記事では、ラット初代ニューロン培養とaRNAの増幅を使用して、その後のトランスクリプトーム解析から単一細胞の収穫のための簡単​​な方法を説明します。このアプローチは、任意の細胞型への一般化です。...

単一細胞のトランスクリプトーム解析

検出限界（50〜75コピー/ ml）以下のウイルス量の個体から血漿とクエンシングにおけるHIV - 1 RNAのレベルを定量シングルHIV - 1ゲノムは困難です。ここでは、確実に0.3コピー/ mLにHIV - 1...

標準的な臨床アッセイによる検出限界以下のウイルス量とHIV感染個体におけるHIV - 1 RNAを増幅して定量化

私たちは、脳脊髄液（CSF）中のマイクロRNAをプロファイリングするリアルタイムPCRのプロトコルを記述します。 RNA抽出プロトコールを除いて、手順は他の体液、培養細胞、または組織試料から抽出したRNAに拡張することができる。...

定量リアルタイムPCRを用いて脳脊髄液マイクロRNAプロファイリング

私たちは、単一の哺乳類細胞を選別し、各細胞における最大96の標的遺伝子の発現を定量化する方法を説明しています。この方法には、絶対転写産物数の推定を可能にするための内部qPCR標準の使用が含まれます。...

内部標準でFACSおよび定量PCRを用いた単一細胞遺伝子発現プロファイリング

このプロトコルでは、重要なステップとパッチ ・ クランプ後単一のセル多重逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を実行に必要な注意事項をについて説明します。この手法は、あらかじめ決められた一連のホールセルパッチク...

パッチ ・ クランプ後単一のセル多重逆のトランスクリプション ポリメラーゼ連鎖反応

HeLa 細胞を用いた哺乳類細胞周期中に二本鎖 RNA 結合蛋白質キナーゼ rna (PKR) 勉強 RNA インターアクターのための実験的アプローチを提案します。このメソッドは、クロスリンク RNA PKR 錯体と PKR バインド Rna を豊かにする免疫沈降にホルムアルデヒドを利用しています。これらの Rna は、高スループット シーケンスまたは qRT PCR...

哺乳類の細胞周期中に RNA 活性化蛋白質キナーゼの RNA インターアクターを勉強

cDNAの速度論的架橋と解析は、生細胞におけるタンパク質-RNA相互作用のダイナミクスを高い時間分解能で調べることができる方法です。ここでは、酵母細胞の増殖、UV架橋、収穫、タンパク質精製、次世代シーケンシングライブラリ調製ステップなど、プロトコルについて詳しく説明します。...

χCRACを用いたin vivoでのタンパク質-RNA相互作用ダイナミクスの高時間分解能モニタリング

本稿では、単一またはバルク C.エレガンス...

ナノ流体技術を用いた単一およびバルク C.エレガンス サンプルにおける高スループット定量RT-PCR

学ぶ アコースティックマイクロストリーミングを用いたマイクロミキサーによる単細胞mRNAからのcDNA収量増加法。標準的な逆転写反応で遺伝子発現解析の精度向上を実現する革新的なバイオテクノロジー技術です。

アコースティックMicrostreamingを使用して標準的な実験系逆転写反応でmRNAの単セルの物理量からcDNA収量を増加させる

さらに動画を探す