ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いた環境ウイルスのコミュニティから一本鎖DNA、二本鎖DNAとRNAの分離

このビデオでは、混合ウイルスの集合体をその核酸組成に基づいて分離する手順を示しています。これにより、複雑なウイルス群集の分類学的多様性と機能的可能性の研究が可能になります。ここでは、リン酸カルシウムの結晶形であるヒドロキシアパタイトが核酸の分離に使用されます。

まず、ハイドロキシアパタイトカラムを充塡し、平衡化精製ウイルス核酸をカラムに印加すると、ハイドロキシアパタイトの正に帯電したカルシウムイオンと核酸サブタイプの負に帯電したリン酸骨格との間の電荷相互作用により、核酸をカラムに結合するニック。次に、一本鎖、D-N-A-R-N-A、および二本鎖DNAを、異なる濃度のリン酸緩衝液で順次言及します。得られた核酸は、DNAシーケンシングによる視覚化、定量化、および同定のために調製するために脱塩および濃縮されます agros gel電気泳動により、核酸種が9%未満のキャリーオーバーで分離できることが確認されます。

したがって、この方法により、ウイルス群集の多様性と機能的能力の評価が可能になります。こんにちは、私の名前はダグ・フロで、j Craig Venture InstituteのDr.Shannon Williamsonの研究室で研究員をしています。今日は、環境ウイルス群から一本鎖DNA二本鎖DNAとRNAを分離する手順をお見せします。

この方法は、DNAまたはRNAのいずれかを標的とする核による治療などの既存の方法よりも優れています。ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、ウイルスコミュニティ全体を捕捉する能力を持っています。この方法により、ウイルス生態学の分野でいくつかの質問に答えることができます。

例えば、遺伝子全体の補体やウイルス群集の多様性はどの程度でしょうか?この方法を最初に考えたのは、遺伝的シグネチャのサブセットを犠牲にすることなく、チェサピーク湾のリオプランクトン群集全体を研究したいと思ったときでした。この実験に必要な溶液は、付属の書面によるプロトコルの指示に従って事前に調製する必要があり、0.12モルリン酸緩衝液、0.20モルリン酸緩衝液、0.40モルリン酸緩衝液、および1モルリン酸溶液が含まれます。

すべてpH 6.8で、実験当日に水和ヒドロキシアパタイトで、すべてのリン酸緩衝液と水和ヒドロキシアパタイトを摂氏60度の水浴に入れて平衡化します。この手順は、ウイルス核酸の分離に使用するエコノカラムを調製することから始めます。エコノコラムの端に活栓を取り付け、閉じていることを確認します。

ピペッターを使用して脱イオン水をカラムに加え、キャップをカラムの上部に置き、カラムを反転させて繰り返しすすぎます。水を注ぎ、この洗浄を数回繰り返します。次に、ストップコックをエコンカラムから取り外し、オートクレーブして滅菌します。

ストップコックは溶けてしまうためオートクレーブではありません。ストップコックをイオン化水ですすぎ、次に70%エタノールで再度すすぎ、オートクレーブ後に自然乾燥させます。ストップコックを交換して閉じます。

次に、ヒュームフードで作業し、カラムに1ミリリットルのシグマコートを追加し、ここに示すようにカラムを転がり運動で反転させてカラムガラスをコーティングします。シグマコートでコーティングすることで、ガラス表面への核酸の付着を最小限に抑えることができます。分離中に、1つの塩ガラス表面がコーティングされています。

ストップコックを開き、円錐形のチューブにデカントします。次に、カラムを循環水浴に接続するには、2つのクランプを使用してカラムをリングスタンドに取り付けます。循環水浴からシリコンチューブを取り付けて、水浴からの水の流れが下から上になるようにします。

温度を60°Cに設定し、循環を開始します。実際には、カラムとチューブは、アルミホイルや発泡パイプ断熱材などの絶縁剤で包まれます。熱損失を最小限に抑えるために、この手順はここでは示されていません。

手順をよりよく視覚化するために、ストップコックを閉じます。ピペッターを使用して、10ミリリットルの滅菌RNAフリー水を追加します。ストップコックを開き、水を排出します。

その後、2回目の洗浄後に再度洗浄します。洗浄の合間に、10ミリリットルの滅菌RNA遊離0.12モルリン酸緩衝液およびデカントで2回すすぎます。これで、カラムはハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーの準備が整いました。

econカラムストップコックが閉じていることを確認します。次に、滅菌済みの2ミリリットルの血清ピペットを使用して、準備した再懸濁したヒドロキシ食欲を2ミリリットルゆっくりとカラムの底に加えます。コラムキャップを交換してください。

ヒドロキシの食欲が重力の下で30分間落ち着くのを待ちます。この方法では、細部にまで注意を払う必要があります。ヒドロキシ食欲カラムは、毎分0.25〜0.5ミルの速度で処理されます。

そのため、カラムが乾かないように、カラムを注意深く監視することが非常に重要です。30分が経過したら、ストップコックを開いてバッファーを廃棄物容器に排出します。ストップコックを閉じて、流れを捨てます。

核酸を0.12モルリン酸緩衝液と混合し、最終容量500マイクロリットルでインキュベートし、摂氏60度で10分間インキュベートします。これにより、核酸がカラムの温度に平衡化され、存在する可能性のある二次構造が除去されるため、異なる核酸種の分離が促進されます。2ミリリットルの血清ピペットを使用して、カラムを邪魔しないようにしながら、核酸溶液をヒドロキシ食欲にすばやく塗布します。

500マイクロリットル全体がカラムに流れ込むと、少量の0.12モルリン酸緩衝液をカラムの上部に追加して、乾燥を防ぐことができます。核酸がヒドロキシ食欲に30分間結合するのを待ちます。結合インキュベーションに続いて、15ミリリットルの円錐管をカラムの下に置きます。

次に、ストップコックを開き、一本鎖DNAを含む最初の500マイクロリットルのサンプルを収集します。500マイクロリットルが収集されたら、ストップコックを閉じます。次に、6ミリリットルの0.12モルリン酸緩衝液をヒドロキシアペイトに加え、カラムを乱さないようにします。

次に、ストップコックを開き、前のステップと同じ15ミリリットルチューブに一重項鎖DNAを含む流れを引き続き収集します。約6ミリリットルを集めたら、活栓を閉じます。ボルテックスにより激しく混合したチューブにフェノールクロロホルムイソアミルアルコール溶液の1容量を加え、次いで3,500倍Gで15分間遠心分離する。

遠心分離後、チューブには2つの層が含まれます。DNAの一本鎖を含む上部のアキュイス層を新しい15ミリリットルチューブに移し、サンプルを室温で保存してRNAを溶出および精製しますカラムから、6ミリリットルの0.20モルリン酸緩衝液を追加し、新しい15ミリリットルのチューブを使用する前にフロースルーを収集します。次に、フェノールクロロホルム抽出を行います。

一本鎖DNAサンプルについては、6ミリリットルの0.40モルリン酸緩衝液を使用してこのプロセスを繰り返し、カラムから二本鎖DNAを溶出および精製します。最後に、カラムから残留ダブレット鎖DNAを取り除きます。このプロセスをもう一度繰り返します。

今回は、6ミリリットルの1.00モルリン酸緩衝液を使用して核酸サンプルを脱塩しました。各サンプルの4〜5ミリリットルをアノンウルトラ4遠心フィルター装置に移し、30、000分子量のカットオフウルトラ細胞膜濃縮サンプルを装備し、500マイクロリットル未満に、固定角度ローターで摂氏30度で6、000GSで回転させます。フロースルーを廃棄した後、残りのサンプルをフィルターに追加します。

RNAフリーのXTEバッファー1個で容量を最大4〜5ミリリットルにします。その後、濃縮されたボリュームが得られるまで再び回転します。スピンの約5分後、4〜5ミリリットルのRNAフリー1XTEバッファーをフィルターに加え、濃縮します。

再度、この洗浄を繰り返し、さらに5回繰り返して、核酸サンプルを完全に脱塩します。サンプルが完全に濃縮され、脱塩されたら、残りの核酸サンプルを滅菌済みの1.7ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。酢酸ナトリウムの10分の1の容量、100%エタノールの2つの容量、および1マイクロリットルのグリコブルーをボルテックス遠心分離機でよく混合することにより、核酸を沈殿させます。

A 28, 000 GS 4°C ケントまで60分。ペレットを邪魔しないように注意してください。

300マイクロリットルの70%エタノールを28, 000 GSの室温で10分間回転させ、乾燥させないようにして、各画分を適切な量のRNAに再懸濁します。遊離TEバッファーのウイルス核酸M 13 MP 18、一本鎖DNA MS2本一本鎖、RNA FI6本二本鎖DNAを組み合わせ、このビデオに示すように、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを使用して分離しました。等濃度の M 13 MP 18、一本鎖 DNA、MS 2、一本鎖、RNA 5 6 二本鎖、RNA および Lambda 二本鎖 DNA をレーン 6 に示すように組み合わせ、ここに見られるようにヒドロキシアパタイトカラムに適用しました。

一本鎖 D-N-A-R-N-A および二本鎖 DNA を、0.12 モル、0.18 モル、0.40 モル、および 1.00 モルのリン酸バッファーを使用して、Hydroxyapatite カラムから独立して言及しました。ゲノムサイズを確認するために、1 KBのラダーを使用しました。これらの結果は、この方法を使用して、1つの画分から次の画分へのキャリーオーバーが9%未満の一本鎖DNAおよびRNAをうまく分離できることを示しています。

この方法は、ここに示すように、チェサピーク湾内のウイルス群集から単離された核酸を分離するためにも使用されました。一本鎖 D-N-A-R-N-A および二本鎖 DNA は、レーン 1 の 0.12 モル、0.20 モルおよび 0.40 モル、またはレーン 2 の 1.00 モルの高質量 DNA ラダーとレーン 2 の 1 KB ラダーのリン酸塩バッファー濃度を使用して独立して言及され、ここで見られるように、核酸のおおよその分子量と質量を視覚的に確認しました。 二本鎖DNAは、チェサピーク湾のベリオプランクトンから抽出された主要な核酸タイプでした。このビデオを見れば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを使用して混合ウイルス集合体から核酸を分離する方法を十分に理解できるはずです。

これには、ハイドロキシアパタイトカラムと核酸の調製、さまざまな濃度のリン酸緩衝液を使用した核酸の分離と錯覚、脱塩、分離後の核酸の濃縮が含まれます。