Name: ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いた環境ウイルスのコミュニティから一本鎖DNA、二本鎖DNAとRNAの分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 46 s
Description: 学ぶ ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて環境ウイルスコミュニティから一本鎖DNA、二本鎖DNA、RNAを分離する方法。9%未満のキャリーオーバーで効率的に核酸を分離し、ウイルス多様性と機能性の研究を支援します。

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この研究は、科学（BER）、米国エネルギー省、協力協定がないの局によってサポートされていました。デFC02 - 02ER63453、国立科学財団の微生物ゲノムシーケンシングプログラム（受賞番号0626826と0731916）。我々は、環境サンプルのコレクションを持つ彼の援助のための彼の技術的専門知識とアドバイスとK.エリックWommack用ジョングラスに感謝。

1。溶液の調製ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを行う前に、リン酸緩衝液を準備する必要がありますし、ハイドロキシアパタイトは、適切に水和でなければなりません。 <ol><li> 1Mリン酸溶液、pHを6.8：1Lフラスコ中の滅菌、DEPC処理H 2 O 1Lのナトリウムリン酸一塩基の119.98グラムを溶解滅菌、DEPC処理H 2 O 1Lのナトリウムリン酸二塩基の141.96グラムを溶解することによって1Lフラスコに1Mリン酸ナトリウム、二塩基溶液を調製1:1の割合でモノ - 及びジ - ソリューションを組み合わせる。マグネチックスターラーバーを用いて撹拌プレートとのミックスでフラスコを置きます。水酸化ナトリウム（pHを増加させる）またはリン酸（pHを下げるために）追加することで6.8にpHを調整する。 </li><li> 0.12Mリン酸緩衝液：500ミリリットルのフラスコで、1Mリン酸溶液、10％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）のpHを6.8、2.5ミリリットル、および0.5M EDTA 5mlのの30ミリリットル組み合わせる。 225ミリリットルの容積に無菌、DEPC処理水を追加。 6.8にpHを調整する。 250ミリリットルに滅菌、DEPC処理水を追加。オートクレーブ。 </li><li> 0.18Mリン酸緩衝液：500ミリリットルのフラスコで、1Mリン酸溶液、10％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）のpHを6.8、2.5ミリリットル、および0.5M EDTA 5mlのの45ミリリットル組み合わせる。 225ミリリットルの容積に無菌、DEPC処理H 2 Oを追加。 6.8にpHを調整する。 250ミリリットルに滅菌、DEPC処理H 2 Oを追加。オートクレーブ。 </li><li> 0.20Mリン酸緩衝液：500ミリリットルのフラスコで、1Mリン酸溶液、10％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）のpHを6.8、2.5ミリリットル、および0.5M EDTA 5mlの50mlのを組み合わせる。 225ミリリットルの容積に無菌、DEPC処理H 2 Oを追加。 6.8にpHを調整する。 250ミリリットルに滅菌、DEPC処理H 2 Oを追加。オートクレーブ。 </li><li> 0.40 Mリン酸緩衝液：500ミリリットルフラスコに、1Mリン酸溶液、10％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）のpHを6.8、2.5ミリリットル、および0.5M EDTA 5mlの100mlの組み合わせ。 225ミリリットルの容積に無菌、DEPC処理H 2 Oを追加。 6.8にpHを調整する。 250ミリリットルに滅菌、DEPC処理H 2 Oを追加。オートクレーブ。 </li><li> "1.00Mリン酸緩衝液は、"（このソリューションではリン酸塩の実際の濃度は0.91 Mです）：500ミリリットルのフラスコで、10％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の1Mリン酸溶液、pH6.8、2.5ミリリットルの30ミリリットル組み合わせ、および5ミリリットルの0.5M EDTA。 225ミリリットルの容積に無菌、DEPC処理水を追加。 6.8にpHを調整する。 250ミリリットルに滅菌、DEPC処理H 2 Oを追加。オートクレーブ。 </li><li>ハイドロキシアパタイト水和：水酸アパタイトの1グラムから重量と50mlのチューブに加える。ハイドロキシアパタイトに0.12Mリン酸緩衝液の6ミリリットルを追加し、混在させる反転。前の60℃に温度を持って使用して、よく混ぜます。 4で長時間℃で保存</li><li>使用前に、60℃ですべてのリン酸緩衝液および水和ハイドロキシアパタイトを平衡化</li></ol> 2。エコノ-カラムの準備<ol><li>コックを閉じます。繰り返し列を反転し、デカンテーションによって脱イオンH 2 Oでカラムを数回すすいでください。 </li><li>エコノ-カラムから活栓を取り外し、滅菌するためにカラムをオートクレーブ。 </li><li>交換して、コックを閉じてください。エコノ-カラム滅菌とコート、すべてのガラスの表面にSigmacoteの1mlを追加します。コックとデカントを開きます。 </li><li>循環水浴にカラムを取り付け、60に温度を℃に設定このようなアルミ箔または発泡パイプの断熱材などの絶縁剤でカラムをラップ列全体に熱損失の最小量をeinsureすることをお勧めします。 </li><li>滅菌、RNaseフリーの0.12Mリン酸緩衝液で2回その後滅菌、RNaseフリーのH 2 Oで二回エコノ-カラムを洗浄します。 </li></ol> 3。 Hydroxypaptiteクロマトグラフィ<ol><li>コックが閉じていることを確認し、徐々に滅菌2ミリリットル血清ピペットを使用してエコノ-カラムの底部に事前に準備、再懸濁したアパタイトの2ミリリットルを追加します。 </li><li>ハイドロキシアパタイトは、30分間重力の力で解決することができます。 </li><li>列と密接なコックからバッファをドレイン。 60℃ヒートブロックまたは水浴で10分間。における500μlのインキュベートの最終容量に0.12Mリン酸緩衝液と核酸を結合する</li><li>すぐに列を乱さないように確実に2ミリリットル血清ピペットを用いてハイドロキシアパタイトに0.12Mリン酸緩衝液で調製された核酸を適用します。 </li><li>核酸は30分間ハイドロキシアパタイトに結合することができます。 </li><li>列の下に15ミリリットルチューブを置き、栓を開き、ssDNAを含む最初のサンプルを収集する。コックを閉じます。 </li><li> 、列を乱すストップコックを開き、前のステップから15ミリリットルチューブで一本鎖DNAを収集することではないことを確認してハイドロキシアパタイトに0.12Mリン酸緩衝液の6ミリリットルを追加。コックを閉じます。 </li><li>フェノール：クロロホルム：1容量の追加チューブにイソアミルアルコール（25:25:1、V / v / v）溶液を、精力的にミックスし、15分間3500 × gで遠心。新しい15ミリリットルチューブに上清を含むssDNAを転送する。 </li><li> eに0.20Mリン酸緩衝液の6ミリリットルを用いて3.76と3.87を繰り返します。リュートとコレクションのために新たな15ミリリットルチューブを使用することを確認して列からRNAを精製する。 </li><li>コレクションのために新しい15ミリリットルチューブを使用することを確認して列から二本鎖DNAを溶出し、精製する0.40Mリン酸緩衝液の6ミリリットルを用いて3.76と3.87を繰り返します。 </li><li>コレクションのために新しい15ミリリットルチューブを使用して確実に残存するdsDNAの列を除去する1.00Mリン酸緩衝液の6ミリリットルを用いて3.76と3.87を繰り返します。 </li></ol> 4。核酸サンプルを脱塩<ol><li> 3万分子量を装備したアミコンウルトラ-4遠心フィルターデバイスへのサンプルの4〜5ミリリットルの転送はUltracel膜を切断。 </li><li> 6000 × gで、30 °アングルローターでC、5分（または濃縮されたボリュームが達成されるまで）で回転させて&lt;​​500μLにサンプルを集中する。フロースルーを捨てます。 </li><li>アミコンウルトラ-4遠心フィルターデバイスにサンプルの残りの部分（s）を追加し、RNaseフリー1 × TEバッファーで4〜5ミリリットルにボリュームを起動します。 </li><li> 6000 × gで、30 °アングルローターでC、5分（または濃縮されたボリュームが達成されるまで）で回転させて&lt;​​500μLにサンプルを集中する。フロースルーを捨てます。 </li><li>アミコンウルトラ-4遠心フィルターデバイスにRNaseフリー1 × TEバッファーの4〜5ミリリットルを追加。 6000 × gで、30 °アングルローターでC、5分（または濃縮されたボリュームが達成されるまで）で遠心分離することによって&lt;500μLにサンプルを集中する。フロースルーを捨てます。 </li><li>完全に核酸サンプル（s）を脱塩するために、ステップ4.5の追加の5回を繰り返します。 </li><li>滅菌1.7ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブに、残りのサンプル（s）を転送する。 10分の1の体積の3M酢酸ナトリウム、pH 7.0の、100％の2倍量のエタノール、及びGlycoblueの1μlを追加します。ボルテックスでよく混ぜる。 </li><li> 28000 × gで、4℃、60分間遠心する。デカントは、ペレットを妨害しないことを確認して。 70％エタノール300μlを追加。 28000 × gで、10分間室温でスピン。 、デカント乾燥およびRNaseフリーのTEバッファーの適切な量で各画分を懸濁します。 </li></ol> 5。代表的な結果： 図1は、混合ウイルスの集合体から分画するのssDNA、dsDNAをし、RNA核酸にハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを使用するための提示方法をまとめたものです。このメソッドは、核酸の負に荷電したリン酸骨格と正に荷電したのCa 2の間の電荷の相互作用を活用して+イオンがハイドロキシアパタイトに存在すると増加するリン酸緩衝液の濃度で核酸のサブタイプの効率的な分画（ssDNAのは、dsDNAやRNA）を可能に12。 既知のssDNA（M13mp18）は、dsDNA（ラムダ）とRNA（MS2とphi6）ウイルスゲノムの in vitroでの"コミュニティ" でのハイドロキシアパタイト分別を図2に示されています。核酸は、同じ濃度で結合ハイドロキシアパタイトカラムに適用し、リン酸緩衝液の濃度の増加を用いて溶出させたていた。各核酸のサブタイプが9％以下が次の1つの画分からキャリーオーバーで互いに独立して溶出する。 チェサピーク湾から採取したウイルスのコミュニティから単離された核酸にこの技術の応用を図3に示されています。精製ウイルスから単離した全核酸の収量がハイドロキシアパタイトカラムに適用された。 ssDNAは、RNAおよび二本鎖DNAから成るゲノム材料を独立してそれぞれ0.12M、0.20M及びリン酸緩衝液の0.40M/1.00M濃度で溶出した。二本鎖DNAは、0.40Mと1.00Mのリン酸濃度で溶出し、このケースでは、ssDNAはとRNA遺伝子型に比べてこのウイルスのコミュニティを支配している。この観察は、回復可能な核酸の大半はdsDNAを13である海洋および河口環境の予想されるウイルスの群集組成と一致している。 <img src="/files/ftp_upload/3146/3146fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 核酸の分画のためのハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー法の図1。フロー図。 0.12Mリン酸緩衝液で調製されたssDNAを、二本鎖DNAとRNAの混合物を60℃に加熱し、一定の60℃に維持ハイドロキシアパタイトカラムに適用されます℃の循環水浴を使用して。核酸（ssDNAは、RNAおよび二本鎖DNA）はリン酸塩を含む緩衝液の濃度の増加とともにハイドロキシアパタイトから溶出される。この図は、微生物学のアメリカの社会からの許可を得て複製されており、もともとアンドリュース- Pfannkochらで紹介されました。 2010 12。 <img src="/files/ftp_upload/3146/3146fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて既知のウイルス核酸の分離。 M13mp18 ssDNAは、MS2 ssRNA、phi6 dsRNA及びラムダ鎖DNA（それぞれレーン2-5、）の等しい濃度を組み合わせて（レーン6）およびハイドロキシアパタイトカラムに適用した。 Singl電子本鎖DNA（M13mp18）、RNA（MS2/phi6）とdsDNA（ラムダ）は独立して0.12M（レーン8）、0.18M（レーン9）と0.40M/1.00M（レーン10）を用いてハイドロキシアパタイトカラムから溶出した。 1キロバイトラダー（レーン1、7）ゲノムサイズを確認するために使用されていました。この図は、微生物学のアメリカの社会からの許可を得て複製されており、もともとアンドリュース- Pfannkochらで紹介されました。 2010 12。 <img src="/files/ftp_upload/3146/3146fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。チェサピーク湾の中でコミュニティから分離されたウイルス核酸の分離。核酸を単離し、ハイドロキシアパタイトカラムに適用した。 ssDNAは（レーン0.12M）、RNA（レーン0.20M）及びdsDNAが（レーン0.40M/1.0M）独立してそれぞれ、0.12M、0.20Mと0.40M/1.00Mのリン酸緩衝液の濃度を用いて溶出した。ハイマスDNAラダー（レーンL1）および1キロバイトラダー（レーンL2）は、視覚的に核酸のおおよその分子量と質量を確認するために使用されていました。この図は、微生物学のアメリカの社会からの許可を得て複製されており、もともとアンドリュース- Pfannkochらで紹介されました。 2010 12。

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<li>Wommack, K. E., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virioplankton%3A+Viruses+in+Aquatic+Ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 64, 69-69 (2000).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここで紹介するハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーの手法は、目的は社会の総核酸組成を研究する場合の混合ウイルスの集合体からの核酸の分画のための非常に効率的かつ堅牢なツールです。一般的に、ssDNAを、RNAおよび二本鎖DNAは約〜0and 0.40Mそれぞれより大きい列フォーリン酸塩緩衝液の濃度から溶出されます。それが既知の核酸（耕作ウイルス調製からなど）を使用して、それぞれ準備をテストすることが重要であるので、しかし、ハイドロキシアパタイトの各調製物は、わずかに異なる組成及び溶出プロファイルを持つことができます。これにより、ユーザは所望の核酸を溶出するために必要なリン酸塩含有バッファの特定の濃度を把握することができます。 このテクニックの制限要因は、核酸のリン酸骨格を結合することができるハイドロキシアパタイト内に存在可能なのCa 2 +イオンの量です。列内のハイドロキシアパタイトのcapacityamountは、列に拡大または縮小することができます（ウォータージャケット列と使用されるハイドロキシアパタイトの量の大きさによって決まる）と溶...

<table border="1"><tbody><tr><th>材料名</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td>エコノ-カラム</td><td> Bio - Rad社</td><td> 737-0717 </td><td> 0.7センチメートルIDのパッケージ/ 2 </td></tr><tr><td>ヒドロキシアパタイト</td><td> Bio - Rad社</td><td> 130-0520 </td><td> DNAグレードバイオジェルHTPジェル、100g/td&gt; </tr><tr><td>リン酸ナトリウム、一塩基性</td><td> VWR </td><td> VW1497 - 01 </td><td>一水和物、クリスタル500グラム</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム、二塩基性</td><td> VWR </td><td> VW1496 - 01 </td><td>無水、パウダー500グラム</td></tr><tr><td> DEPC処理水</td><td>インビトロジェン</td><td> AM9922 </td><td> 1L </td></tr><tr><td> 10％SDS溶液</td><td>インビトロジェン</td><td> 24730-020 </td><td>超高純度、1L </td></tr><tr><td> 0.5M EDTA </td><td>インビトロジェン</td><td> AM9262 </td><td> pHは8.0、1L </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> SL2 - 25ML </td><td></td></tr><tr><td> 2ミリリットル血清学的pippette </td><td> VWR </td><td> 89130-884 </td><td>ポリスチレン、滅菌</td></tr><tr><td> BDファルコン遠心管</td><td> VWR </td><td> 21008-936 </td><td> 15ミリリットル、滅菌</td></tr><tr><td>フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1、V / V / V） </td><td>インビトロジェン</td><td> 15593-031 </td><td>超高純度、100ミリリットル</td></tr><tr><td>アミコンウルトラ-4遠心装置</td><td>ミリポア</td><td> UFC803024 </td><td> Ultracel - 30膜</td></tr><tr><td> 20X TEバッファー、RNaseフリー</td><td>インビトロジェン</td><td> T11493 </td><td> 100ミリリットル</td></tr><tr><td> Glycoblue </td><td>インビトロジェン</td><td> AM9516 </td><td> 15mg/ml </td></tr></tbody></table>

ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いた環境ウイルスのコミュニティから一本鎖dna、二本鎖dnaとrnaの分離

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

ウイルス、特にバクテリオファージは（ファージ）、地球1,2上で最も多くの生物学的実体である。ウイルスは宿主細胞の表現型を変更する、栄養素の循環に寄与する、宿主細胞の豊富さと多様性を調節し、そして遺伝子の3の水平伝達を介して宿主細胞とウイルスの両方のコミュニティの進化に影響を与える。多くの研究は、自然環境の様々なウイルスやその機能性の驚異的な遺伝的多様性を強調している。 メタゲノムの手法は、分類学的多様性とメンバー一本鎖DNA（ssDNA）、二本鎖DNA（dsDNA）とRNAの遺伝子型4-9含む複雑なウイルス群集の機能的な可能性を研究するために使用されている。環境DNAを含む研究に使用される現在のライブラリー構築のプロトコルまたはRNAを含むウイルスは、10非標的化テンプレートを除去するために、初期ヌクレアーゼ処理を必要とする。しかし、ウイルスのコミュニティとウイルスの多様性の集団遺伝子の補数の包括的な理解には関係なく、ゲノム構成のすべてのメンバの知識が必要です。核酸のサブタイプの精製分画は、コミュニティの遺伝の署名の一部を犠牲にすることなくウイルスの集合体を研究することによって効果的なメカニズムを提供します。 ハイドロキシアパタイト、リン酸カルシウムの結晶形は、1960年代11日以来、核酸、ならびにタンパク質や微生物の分離に用いられている。ハイドロキシアパタイトと核酸のサブタイプの負に帯電したリン酸骨格の陽性荷電のCa 2 +イオン間の電荷の相互作用を利用することにより、それは優先的に互いに独立してそれぞれの核酸のサブタイプを溶出することが可能です。我々は最近、DNAシークエンシング12の準備にssDNAのは、dsDNAやRNAを含むウイルスの独立画するゲノムにこの戦略を採用。ここで、我々は、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィを用いて混合したウイルスの集合体からのssDNA、dsDNAをし、RNAウイルス核酸の分画と回復のための手法を提案する。

私たちは、環境ウイルスのコミュニティから一本鎖DNA、二本鎖DNAとRNAの分子を分離する効率的な方法を説明します。核酸はリン酸含有緩衝液の濃度の増加とともにヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて分画する。このメソッドは、環境サンプルからすべてのウイルス核酸の種類の分離を可能にします。

ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いた環境ウイルスのコミュニティから一本鎖DNA、二本鎖DNAとRNAの分離

ウイルス、特にバクテリオファージ（ファージ）は、地球上で最も数が多い生物学的存在である1,2。ウイルスは、宿主細胞の量と多様性を調節し、...

このビデオでは、核酸組成に基づいて混合ウイルス集団を分離する手順を解説します。これにより、複雑なウイルス集団の分類学的多様性と機能的ポテンシャルの研究が可能になります。ここでは、リン酸カルシウムの結晶形態であるヒドロキシアパタイトを用いて核酸の分離を行います。まず、ヒドロキシアパタイトカラムを充填して平衡化させ、その後、精製したウイルス核酸をカラムに適用します。ヒドロキシアパタイトの正に帯電したカルシウムイオンと、核酸サブタイプの負に帯電したリン酸バックボーンとの間の電荷相互作用により、核酸がカラムに結合します。次に、単鎖DNA・RNAおよび二本鎖DNAを、異なる濃度のリン酸バッファーを用いて順次溶出させます。得られた核酸を脱塩および濃縮し、可視化、定量化、およびDNAシーケンシングによる同定の準備を行います。アガロースゲル電気泳動により、核酸種が9%未満のキャリーオーバーで分離できることが確認されます。このように、本手法によりウイルスコミュニティの多様性と機能的能力の評価が可能になります。こんにちは、私はDoug Froです。j Craig Venture InstituteのShannon Williamson博士の研究室でリサーチアソシエイトを務めています。本日は、環境ウイルス集団から一本鎖DNA、二本鎖DNA、およびRNAを分離する手順について解説します。本手法は、DNAまたはRNAのいずれかを標的とする核酸抽出などの既存の手法と比較して利点があります。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、ウイルスコミュニティ全体を捕捉することが可能です。この手法を用いることで、ウイルス生態学の分野におけるいくつかの疑問を解決することができます。例えば、総遺伝子組成やウイルスコミュニティの多様性はどのようなものか、といった点です。私たちは、遺伝的シグネチャーの一部を犠牲にすることなく、チェサピーク湾のリオプランクトン群集全体を研究したいと考えた際に、まずこの方法を思いつきました。この実験に必要な溶液は、付属の書面プロトコルの指示に従って事前に調製しておく必要があり、0.12 molar リン酸緩衝液、0.20 molar リン酸緩衝液、0.40 molar リン酸緩衝液、および 1 molar リン酸溶液が含まれます。すべてpH 6.8とし、実験当日に、すべてのリン酸緩衝液と水和ヒドロキシアパタイトを60 °Cのウォーターバスに置いて平衡化します。まず、ウイルス核酸の分離に使用するエコノカラムを準備して、この手順を開始します。エコノカラムの端にストップコックを取り付け、それが閉じていることを確認してください。ピペッターを用いてカラムに脱イオン水を加え、カラム上部にキャップを閉めて、カラムを繰り返し反転させて洗浄します。水を捨て、この洗浄工程を数回繰り返します。次に、econカラムからストップコックを取り外し、オートクレーブで滅菌します。ストップコックは溶けるため、オートクレーブ処理しないでください。ストップコックをイオン水で洗浄し、次に70%エタノールで洗浄した後、オートクレーブ後の乾燥まで自然乾燥させてください。ストップコックを取り付け、閉じます。次に、ドラフトチャンバー内で、Sigma Coatを1 mLカラムに加え、ここで示すようにカラムを回転させながら反転させて、カラムのガラス面をコーティングします。Sigma Coatでコーティングすることで、核酸のガラス表面への吸着を最小限に抑えることができます。分画の間、ガラス表面がコーティングされた状態になります。ストップコックを開き、コニカルチューブにデカンテーションします。次に、カラムを循環水槽に接続するため、2つのクランプを使用してカラムをリングスタンドに固定します。循環水槽からシリコンチューブを接続し、水槽からの水の流れが下から上に向かうようにします。温度を60 °Cに設定し、循環を開始します。実際には、熱損失を最小限に抑えるため、カラムとチューブをアルミホイルやフォーム管絶縁材などの断熱材で包みますが、この手順はここでは省略しています。手順をより明確に視覚化するため、ストップコックを閉じます。ピペッターを用いて、滅菌済みのRNaseフリー水を10 milliliters加えます。ストップコックを開き、水を排出させます。次に、2回目の洗浄に従って再度洗浄します。10 millilitersの滅菌済みRNase free 0.12 molar リン酸緩衝液で2回リンスし、洗浄ごとに液を捨てます。これで、カラムはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに使用できる状態になります。econカラムのストップコックが閉じていることを確認します。次に、滅菌済みの2 mLセロロジカルピペットを用いて、調製した再懸濁済みの再水和ヒドロキシアパタイト2 mLをカラムの底部にゆっくりと加えます。カラムキャップを戻します。ヒドロキシアパタイトを重力下で30分間静置させます。この手法では細部への注意が必要です。ヒドロキシアパタイトカラムの処理速度は0.25〜0.5 mL/minです。したがって、カラムが乾燥しないよう注意深く監視することが非常に重要です。30分後、ストップコックを開いてバッファーを廃棄容器に排出します。ストップコックを閉じ、フロースルーを廃棄してください。核酸を0.12 molar リン酸緩衝液で最終容量500 µLとなるように混合し、60 °Cで10分間インキュベートします。これにより、核酸をカラムの温度に平衡化させ、存在する可能性のある二次構造を除去することで、異なる核酸種の分離能を高めることができます。2 mLのセロロジカルピペットを用いて、カラムを乱さないように注意しながら、核酸溶液をヒドロキシアパタイトに迅速に適用します。500 µLすべてがカラムに流入したら、カラムの乾燥を防ぐために少量の0.12 M リン酸バッファーをカラム上部に加えます。核酸をヒドロキシアパタイトに30分間結合させます。結合インキュベーションの後、カラムの下に15 mLコニカルチューブを設置します。次に、ストップコックを開き、単鎖DNAを含む最初の500 µLのサンプルを回収します。500 µLの回収が完了したら、ストップコックを閉じます。続いて、カラムを乱さないように注意しながら、ヒドロキシアパタイトに0.12 Mのリン酸緩衝液を6 mL加えます。次にストップコックを開き、前ステップと同じ15 milliliterチューブに、シングルストランドDNAを含むフロースルーを回収し続けます。約6 milliliters回収した後、ストップコックを閉じます。チューブに1容量分のフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール溶液を加え、ボルテックスミキサーで激しく混合し、その後3,500 ×gで15分間遠心分離します。遠心分離後、チューブ内は2層に分かれます。一本鎖DNAを含む上層を新しい15 milliliterチューブに移し、室温で保存します。カラムからRNAを溶出・精製するために、0.20 molarリン酸緩衝液を6 milliliters加え、新しい15 milliliterチューブを用いてフロースルーを回収します。その後、フェノール・クロロホルム抽出を行います。一本鎖DNA試料については、6 mLの0.40 Mリン酸緩衝液を用いてこの工程を繰り返し、カラムから二本鎖DNAを溶出および精製します。最後に、カラムに残存する二本鎖DNAを完全に除去するため、この工程をもう一度繰り返します。今回は、核酸サンプルの脱塩に1.00 Mのリン酸緩衝液を6 mL使用します。各サンプル4〜5 mLを、分画分子量30,000のウルトラセル膜を備えたUltra-4遠心フィルターデバイスに移します。固定角ローターを用いて30 °Cで6,000 ×gにて約5分間遠心し、サンプルを500 µL未満まで濃縮します。ろ液を廃棄した後、残りのサンプルをフィルターに加えます。RNaseフリーの1X TEバッファーを用いて、液量を4〜5 mLまで増やします。その後、目的の濃縮量が得られるまで再度遠心分離を行います。遠心後約5分経ってから、フィルターに4〜5 mLのRNaseフリーの1X TEバッファーを加え、濃縮させます。同様に、この洗浄をさらに5回繰り返し、核酸サンプルを完全に脱塩します。サンプルの濃縮と脱塩が完了したら、残った核酸サンプルを滅菌済みの1.7 milliliterマイクロ遠心チューブに移します。溶液量の1/10量の酢酸ナトリウム、2倍量の100% ethanol、および1 microliterのglyco blueを加え、ボルテックスミキサーで十分に混合した後、遠心分離して核酸を沈殿させます。4°Cで28,000 ×g、60分間遠心分離します。ペレットを乱さないように注意してください。70%エタノールを300 µL加え、室温、28,000 ×gで10分間遠心分離し、乾燥させた後、各フラクションを適切な量のRNaseフリーTEバッファーに再懸濁します。等濃度のウイルス核酸であるM13 MP18（一本鎖DNA）、MS2（一本鎖RNA）、Φ6（二本鎖RNA）、およびλ（二本鎖DNA）を混合し、本ビデオに示すようにヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて分離しました。レーン6に示すように、等濃度のM13 MP18（一本鎖DNA）、MS2（一本鎖RNA）、Φ6（二本鎖RNA）、およびλ（二本鎖DNA）を混合し、ここに示すようにヒドロキシアパタイトカラムに供しました。一本鎖DNA、RNA、および二本鎖DNAを、0.12 molar、0.18 molar、0.40 molar、および1.00 molarのリン酸緩衝液を用いてヒドロキシアパタイトカラムから個別に溶出させた。ゲノムサイズを確認するために1 KBラダーを使用した。これらの結果は、本手法を用いることで、分画間のキャリーオーバーを9%未満に抑えつつ、一本鎖DNA、二本鎖DNA、およびRNAを良好に分離できることを示している。この手法は、ここに示すように、チェサピーク湾内のウイルスコミュニティから単離された核酸の分離にも用いられました。一本鎖DNA/RNAおよび二本鎖DNAは、それぞれ0.12 molar、0.20 molar、0.40 molar、または1.00 molarのリン酸緩衝液濃度を用いて独立して溶出されました。レーン1には高分子量DNAラダーを、レーン2には1 KBラダーを用いて、核酸のおおよその分子量と質量を視覚的に確認しました。ここで見られるように、チェサピーク湾のウイルスプランクトンから抽出された核酸の中で、二本鎖DNAが主要なタイプでした。このビデオを視聴することで、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて混合ウイルス群から核酸を分離する方法について十分に理解できるはずです。これには、ヒドロキシアパタイトカラムおよび核酸の調製、さまざまな濃度のリン酸緩衝液を用いた核酸の分離と溶出および脱塩、そして分離後の核酸の濃縮が含まれます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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24ウェルラックを用いた中スループットカラムDNA抽出

学ぶ ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて環境ウイルスコミュニティから一本鎖DNA、二本鎖DNA、RNAを分離する方法。9%未満のキャリーオーバーで効率的に核酸を分離し、ウイルス多様性と機能性の研究を支援します。

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