蛍光In Situハイブリダイゼーション後のマウス脳切片におけるニューロンの免疫染色

コリンアセチルトランスフェラーゼを発現するコリン作動性ニューロンを含む、固定および透過処理されたマウスの脳スライスを取ります。

スライスを蛍光in situハイブリダイゼーションにかけ、コリン作動性軸索に局在する標的mRNAを検出し、蛍光プローブを使用して増幅されたシグナルを生成し、蛍光顕微鏡で検出します。

タンパク質と急冷剤を含むブロッキング溶液を追加します。タンパク質は非特異的結合を防ぎ、消光剤は残留固定剤を中和します。

ニューロンのコリンアセチルトランスフェラーゼを標的とする一次抗体とインキュベートします。

バッファーで洗浄して、結合していない抗体を除去します。

コリンアセチルトランスフェラーゼ結合一次抗体に結合する蛍光色素結合二次抗体とインキュベートします。

バッファーで洗浄して余分な抗体を除去し、蒸留水ですすぎ、バッファー残留物を除去します。

核にラベルを付けるための核染色を含む封入媒体でスライスをマウントします。

蛍光顕微鏡を使用して、スライスを画像化して、標的mRNAシグナルと特異的抗体で染色されたコリン作動性軸索を視覚化します。

各スライスを、1ミリリットルあたり3ミリグラムのBSA、100ミリモルグリシン、および0.25%トリトンX-100のPBSを含む100〜200マイクロリットルのブロッキング溶液で覆います。各スライドをパラフィルムで覆い、室温で30分間インキュベートします。

イン

キュベーション後、ブロッキング溶液で希釈した100〜200マイクロリットルの抗体をスライドに、抗コリンアセチルトランスフェラーゼ抗体をここで使用します。パラフィルムでスライドを覆った後、摂氏4度で2日間インキュベートします。脳のスライスが乾かないように注意してください。必要に応じて、インキュベーションの24時間後に抗chAT抗体溶液を脳スライスに再塗布します。

スライドを室温で1X PBSで5分間3回洗浄した後、100〜200マイクロリットルの適切なAlexa標識二次抗体をスライドに加えます。パラフィルムで覆い、光から保護しながら室温で1時間インキュベートします。

1時間が経過したら、スライドを1X PBSで5分間、以前と同様に3回洗浄し、蒸留水で1回洗浄します。DAPIを含む封着剤でスライドを取り付けます。そして、蛍光顕微鏡で脳のスライスを視覚化します。