レーザー誘発脳損傷ラットモデルにおける血液脳関門完全性の評価

麻酔をかけた対照ラットとレーザー誘発性脳損傷ラットモデルを取ります。

右半球へのレーザー照射は、細胞と脳組織から血液を分離する血液脳関門(BBB)に損傷

を与えました。

体循環を通って脳に到達するカニューレ付き尾静脈に追跡色素を注入します。

色素は血漿タンパク質に結合し、損傷したBBBを介して脳組織に漏れます。

ネズミを安楽死させます。

ラットを心臓に灌流して、循環から染料を取り除きます。

脳を抽出してスライスし、損傷した半球からスライスを分離し、均質化します。

酸性溶液で処理してタンパク質を変性させ、タンパク質結合色素を放出します。

色素を含む上清を遠心分離して分離します。アルコールを加えて色素の蛍光を高めます。

溶液をマイクロプレートに移します。励起時、損傷した脳の蛍光強度が高いほど、レーザー誘発性BBB損傷を示します。

血液脳関門破壊の発生率を評価するために、レーザー誘発性損傷の24時間後に、生理食塩水1キログラムあたり4ミリリットルで希釈した2%エバンスブルー染料を注射器に装填し、カニューレ付き尾静脈を介して負傷者および対照ラットに溶液を静脈内送達します。

手術用ピンセットとハサミを使用して最初の動物の胸を開く前に、溶液を1時間循環させます。右心房から無色の灌流液が観察されるまで、左心室を介して冷却された0.9%生理食塩水で、110水銀柱の圧力で露出した心臓を灌流します。

次に、脳を採取し、2ミリメートルの吻尾スライスを取得します。左脳スライスを右脳スライスから分離して、損傷した半球と損傷していない半球を別々に評価できるようにし、サンプルの重量を量ります。乳鉢と乳棒を使用してサンプルを均質化し、組織サンプルを50%トリクロロ酢酸で24時間インキュベートします。

翌日、均質化した脳組織サンプルを10,000倍gと室温で20分間遠心分離しました。1ミリリットルの上清と1.5ミリリットルの96%エタノールを1対3の比率で混合します。次に、620ナノメートルの励起と680ナノメートルの発光波長で蛍光検出器を使用して、血液脳関門の破壊を評価します。