HOエンドヌクレアーゼの形成の定量と分析でアニーリングシングルストランドによる染色体転座を刺激サッカロマイセスセレビシエ

この手順の全体的な目標は、二倍体の出芽酵母細胞における一本鎖ひざまずくことによる転座形成の遺伝的制御を決定することです。これは、最初に特定の遺伝子型の単一コロニーを培養物に接種し、それらを一晩で成長させることによって達成されます。手順の2番目のステップは、培養物にガラクトースを添加することにより、2つの染色体上のhoエンドヌクレアーゼによる同時二本鎖切断形成を誘導することです。

次に、これらの培養物の希釈液を選択的培地および非選択的培地に播種します。最後のステップは、選択的培地と非選択的培地に生じるコロニーをカウントすることにより、転座頻度を決定することです。最終的には、一本鎖による転座形成の遺伝的制御を示す結果を得ることができ、異なる遺伝子型の株におけるho刺激転座形成の頻度の変化を通じてひざまずくことである。

この技術の意味するところは、DNAの二本鎖切断と転座形成がこの治療治療の主な結果であるため、がん患者の治療的放射線被ばくの結果にまで及びます。Ho刺激転座頻度を決定するための手順を開始するには、Yピークグリセロール乳酸培地の10〜20の独立した1ミリリットル培養物に、所望の遺伝子型の単一コロニーを接種し、ローテーター上で培養物を摂氏30度で一晩インキュベートする。培養物が所望の細胞密度に達したとき、20%のガラクトースを最終濃度の2%に培養物に加え、ガラクトースは、染色体3上の歴史デルタファイブプリム対立遺伝子で二本鎖ブレークを指示し、染色体15上の3つのデルタスプリム対立遺伝子を有するホエンドヌクレアーゼの発現を誘導し、ローテーター上で摂氏30度で4時間インキュベートします。

次のステップは、手順の成功に不可欠です。培養物の慎重な希釈とめっきが不可欠です。異なる遺伝子型の株間で統計的に有意な比較を可能にするのに十分な再現性のある転座頻度を得る場合は、4時間後に、ヒスチジンを欠く培地およびYPDtdに培養物を適切に希釈し、プレートあたり約100〜200コロニーをプレートごとに2〜3日間インキュベートします。

コロニーが発生すると、転座頻度を決定できます。hoエンドヌクレアーゼ発現の誘導前後のプレーティング効率は、いずれかの転座染色体の有無がDSB形成を生き残る能力に影響を与えるかどうかを示します。これにより、3番染色体と15番染色体の両方の1つのコピーが断片化され、誘導前のプレーティング効率が決定されます。

まず、各一晩の培養物から細胞のアリコートを取り出し、ヘモサイトメーターでカウントして細胞数を決定します。次に、適切な希釈液を用いて約100〜200個の細胞をYPDに播種し、コロニーが形成されるまで摂氏30度で2〜3日間インキュベートします。残りの培養物に20%のガラクトースを最終濃度の2%まで加え、摂氏30度で4時間インキュベートして、誘導後のプレーティング効率を決定します。

導入の4時間後に各培養物から細胞のアリコートを取り出し、ヘモサイトメーターで細胞数を決定します カウントプレート YPDに適切な希釈を使用して約100〜200個の細胞をインキュベートし、コロニーが発生するまで摂氏30度で2〜3日間インキュベートします。プレート上にコロニーが発生すると、めっき効率を判断できます。推定転座担持クローンは、サザンブロットで調べることができます。

この手順では、各独立した試験消化物から各独立した試験消化物から約4マイクログラムのヒスと組換えコロニーから調製されたゲノムDNAを使用し、BAM H、1つの制限エンドヌクレアーゼ、分離BAM、H、1つ、0.7%aros上で断片を分離し、その後、1.8キロベースBMH1つのBMH1つのゲノムクローンを含むゲノムクローンで得られたP32標識プローブとハイブリダイズされた正に帯電したナイロン膜に移します。3つの遺伝子。オートX線撮影またはリン酸化イメージングによりDNA断片を可視化します。推定される転座を持つクローンを調べる別の方法は、染色体プロット分析です。

染色体は、最初に選択されたヒスとアロスの組換え体から調製され、アロスプラグ、輪郭クランプされた均質電界または14°Cのシェフ内の1%アロスゲル上の染色体を分離します。次のパラメータは、最初のブロックで摂氏14度、72回目の切り替え時間、6ボルトセンチメートルで15時間、2番目のブロックで摂氏14度、122回目の切り替え時間、および6ボルト/センチメートルで11時間で使用されます。電気泳動終了後、AUMブロマイドでゲルを30分間染色した後、UVを照射し、キャピラリー作用により正に帯電した膜に染色体を留置蒸留水で移動させることで染色体を可視化します。

変性条件は、ヒスを含む1.8キロベースのbam H one bam H oneゲノムクローンとのランダムプライミングによって得られたP 32標識プローブとハイブリダイゼーションします。3つの遺伝子は、自動X線撮影またはリン酸化イメージングによって染色体を視覚化します。染色体転座の頻度は、ヒスタミン光合成コロニーの数を、YPDにプレーティングして決定された生存細胞の総数で割ることによって計算できます。

この例では、計算された組換え頻度は約3%であり、ho刺激転座頻度のアッセイは、異なる遺伝子型の株を用いて実施し、一本鎖による二本鎖切断を修復する能力の違いを比較することができる。この代表的なグラフに示されているようなひざまずき。RAD 51デルタヌルホモ接合体を用いて選択的におよび非選択的に得られた転座頻度は、誘導プレーティング前および後の両方で野生型株の対応する条件を用いて得られた転座頻度とは統計的に異なっていた。

効率は、この表に示すように、誘導プレーティングの前後に、生細胞形成細胞の総数をヘモサイトメーターカウントによって決定される培養中の細胞体の総数で割ることによって決定されます。効率は野生型細胞で有意差はなく、これは、どちらの転座染色体の有無も生存能力に影響を与えないことを示唆しています。DSBフォーメーション。

推定転座担持クローンは、ゲノムサザンブロット解析によって調べることができます。転座形成前後の関連する染色体のグラフ表現をここに示します。親株および組換え株からのゲノムDNAのBAM H一回の消化によって生成され、1.8キロベースのBAM Hとのハイブリダイゼーションによってブロットで明らかにされた関連配列を含む制限断片のサイズ。

彼の3つのゲノムクローンは、サザンブロット解析のためにキロベースペアでリストされています。ゲノムDNAはBMHワンエンドヌクレアーゼで消化され、1.8キロベースで標識されたP 32にハイブリダイズされます。HISの3つのプローブは、これらの診断フラグメントを視覚化します。

0.8キロベースHIS3デルタ201.7キロベースヒス3デルタ3プライム4キロベースT 3 15 5キロベースT 15 3キロベースT15 3および8キロベースヒス3デルタ5プライムフラグメント。レーン A は親二倍体です。レーンBはヒスプラス非相互転座組換え体であり、レーンCはヒスプラス逆転座です。

組換え染色体BLO解析は、転座担持クローンの検討にも使用できます。arosプラグで調製した無傷の染色体は、シェフの電気泳動によって分離され、ゲルは臭化イリジウムで染色され、UV光の下で視覚化されます。次に、分離した染色体をナイロンにブロットし、1.8キロベースと標識されたP 32とハイブリダイズします。

彼の3つのプローブは、1.1メガベースの無傷の染色体、15.8メガベースのT、15の3つの転座染色体、0.6メガベースのT3、15の転座染色体、および0.3メガベースの無傷の染色体3を視覚化します。レーン A はデプロイされた親です。レーンBはAのプラス非相互転座組換え体であり、レーンCは彼のプラスの相互転座組換え体です。

このビデオを見れば、複数のho刺激による二本鎖切断後の転座形成の頻度を決定する方法についてよく理解できるはずです。