JoVE 実験百科事典
神経科学
0 回視聴 • 3:41 分 • May 29th, 2025
若いニューロンを表す短期ラット海馬ニューロン培養と老化ニューロンを表す長期培養を取り上げます。
老化したニューロンは、高密度のL型電位依存性カルシウムチャネル(L-VGCC)を示し、膜の脱分極時に長時間開いたままになります。
細胞内に拡散する蛍光カルシウム指示薬でインキュベートし、洗浄して余分な色素を除去します。
培養物を蛍光顕微鏡下の灌流チャンバーに入れます。
ニューロン上の受容体に結合し、ナトリウムイオンの流入を誘導し、膜の脱分極を引き起こす神経伝達物質を含む溶液を導入します。
脱分極により L-VGCC が活性化され、細胞質へのカルシウムの流入が可能になります。
長期培養では、L-VGCC の密度が高く、開口が長引くと、ニューロンの老化の特徴であるカルシウム過負荷が引き起
こされます。指示薬へのカルシウム結合は蛍光を生成し、老化したニューロンは刺激時の細胞内カルシウムレベルの上昇を反映して、より高い蛍光強度を示します。
この手順では、細胞をFura2-AMとともに室温で暗所で60分間インキュベートし、カバーガラスを灌流室に移します。その後、カバーガラス付きの灌流室を倒立顕微鏡のホルダーに入れます。顕微鏡視野を選択し、予熱したHBSで細胞を連続的に灌流します。
その後、最終的に340ナノメートルと380ナノメートルで細胞を落射照射し、5〜10秒ごとに520ナノメートルで放出された光を蛍光カメラで記録し、Fura-2ダイクロイックミラーでフィルタリングします。記録された蛍光画像を解析します。まず、実験ファイルを開きます。
AquaCosmosソフトウェアを使用して、比率をクリックし、希望の比率範囲を選択します。一連の比率画像を取得するために、結果の画像のピクセル単位の比率を計算します。次に、背景照明ボタンを調整して背景を差し引きます。その後、 計算の開始.次に、 オールタイムシーケンス ボタンを押して、古いROIを消去します。
個々の細胞の定量分析のために、新しいROIまたは個々のニューロンに対応するROIを確立します。個々の記録をグラフ化するには、グラフをクリックして、各ROIに対応する比率蛍光値をオリジンラボプログラムにエクスポートします。次に、[計算] をクリックして TXT ファイルを保存します。その後、各刺激に応答した蛍光比の上昇の大きさを推定するための対応する計算を行います。