スペクトル反射率測定法を使用して、固定マウス脳スライスの有髄軸索直径を決定する

脳組織のミエリン鞘ナノ構造を解読するために、広いスペクトル範囲に構成された安定化レーザー光源を備えたハイパースペクトル共焦点顕微鏡を取ります。

基準ミラーを使用して、ベースライン反射スペクトルをキャプチャします。ミラーを取り外し、検出器ノイズ補正用のダークオフセットスペクトルを取得します。

固定された脳組織切片を備えたチャンバーを顕微鏡ステージに移します。

焦点面を目的の組織領域に合わせ、ガラスと組織の界面からの干渉を最小限に抑えるのに十分な深さを確保します。

レーザー光は、軸索の多層ミエリン鞘に向けられます。

光がミエリンと相互作用すると、層の界面で部分反射が発生し、層の厚さと屈折率の変化により干渉パターンが生成されます。

これらの干渉パターンのスペクトル画像を取得します。

ベースライン補正と信号分析の後、反射スペクトルは波数の周期性を明らかにし、有髄軸索の直径を決定できます。

顕微鏡ステージに基準ミラーを取り付け、表面を対物レンズに向けます。鏡を顕微鏡ステージに置くのが容易でない場合は、平板に鏡を貼り付けてください。顕微鏡ステージを調整して、焦点面を鏡面に合わせます。次に、検出器のダイナミックレンジを考慮して、PMT ゲインとレーザー出力を調整します。

擬似色の下で、波長範囲全体に彩度がないことを確認します。飽和が観察された場合は、レーザー出力を下げます。次に、ラムダスキャンの取得を実行します。ステージからミラーを取り外し、サンプルなしで同じ取得を繰り返して、暗い基準を取得します。次に、データをマルチスタック TIFF 形式で保存します。

SpeRe画像取得を実行するには、マウントされた組織を顕微鏡ステージに置きます。接眼レンズを通して組織を対物レンズの焦点面に大まかに位置合わせするには、広視野蛍光モードを使用します。ライブスキャンをオンにした状態で、顕微鏡ステージを制御して、焦点面を組織内の関心領域に合わせます。カバーガラスからのバックグラウンドノイズを回避するには、ガラス組織界面から深さ15マイクロメートル以上のターゲット領域を選択します。

このビデオで前半に示したのと同じ手順を使用して、ターゲット領域のスペクトル画像スタックを取得します。次に、組織とダークオフセットのデータをマルチスタックTIFF形式で保存します。ImageJで画像を処理するには、参照ミラーと脳組織のスペクトルデータを開きます。

開いた画像スタックのROI、参照ミラーの中央領域、および脳組織の軸索線維のセグメントを選択します。次に、画像を実行し、スタックし、z軸プロファイルをプロットして、選択したROIの生のスペクトルを取得します。

軸索線維は、その長さに沿って構造的に不均一である可能性があるため、部分的な体積アーティファクトを最小限に抑えるために、通常は5マイクロメートル未満の小さな軸索セグメントでROIを選択することをお勧めします。

参照ミラー用に撮影したデータと脳組織用に撮影したダークオフセットデータを開き、先ほど示したようにz軸プロファイルをプロットします。次に、コピーと貼り付けのオプションを使用して、取得したすべてのオプションを保存します。