表皮内神経線維内のミトコンドリアの可視化

まず、

表皮内神経線維(IENF)、細い感覚ニューロン終末を含む表皮皮膚組織切片から始めます。

IENFはミトコンドリアに豊富で、ニューロン信号伝達にエネルギーを提供します。

組織には、蛍光標識されたIENF、ミトコンドリア、および表皮核があります。

倒立共焦点顕微鏡を使用して、核、IENF、およびミトコンドリアに適した波長で離散蛍光シグナルを順次取得します。

ライブスキャンをアクティブにして、表皮層を囲む IENF 信号をキャプチャします。

次に、各信号に対してシーケンシャルスキャンを実行して、蛍光シグナルのクロストークを除去します。

結合画像から、ソフトウェアを使用して、青色蛍光表皮細胞をトリミングして単離します。

次に、トリミングされた領域を処理して、緑色の IENF シグナルと赤色のミトコンドリアシグナルの解像度を高めます。

次に、3D 表面画像を生成して IENF のマスクを作成し、ミトコンドリア表面画像にオーバーレイして神経特異的ミトコンドリアを分離します。

最終出力では、IENF はシアン色で表示され、ミトコンドリアは小さなマゼンタ色の構造として表示されます。

倒立レーザー走査型共焦点顕微鏡で40倍油浸対物レンズを選択します。適切なレーザーと検出器を選択して、核、神経線維、ミトコンドリアを画像化します。次のスキャンパラメータを顕微鏡ソフトウェアに入力します 12ビット強度分解能。スキャンレートは600Hz、2フレーム平均化、ズームは2.2。1024 x 1024のスキャン解像度を選択して、最適化された横方向の解像度に顕微鏡ソフトウェアを設定します。軸方向の分解能と光学セクショニングを最適化するには、zステップサイズが210ナノメートルの1つのエアリーユニットの共焦点開口部を選択します。

各信号を個別にスキャンし、検出器の電圧とオフセットを調整して、飽和過飽和ピクセルと低飽和ピクセルを除去します。神経信号のライブスキャンをアクティブにし、zフォーカスコントロールを調整して、組織切片内の神経信号を含む上下の焦点面を顕微鏡ソフトウェアで見つけて設定します。最終的なzシリーズをシーケンシャルスキャンでスキャンし、蛍光シグナルのクロストークを除去します。

元の画像の複製画像に選択ツールを使用して、表皮の周囲に領域を描画することにより、表皮を角質層と真皮から分離します。次に、画像を選択範囲にトリミングします。スプレッド関数の計算機能を使用して、緑色および赤色の蛍光共焦点シグナルのポイントスプレッド関数を計算します。次に、オイルの中屈折率のパラメータを1.515に設定し、40倍のオイル対物レンズの開口数を1.25に設定します。検出器のピンホールを1つの領域、単位に設定し、レーザー励起波長を選択します。

反

復復元を100%の信頼度に設定し、反復制限を10サイクルにし、緑と赤の蛍光シグナルのデコンボリューションに緑と赤のPSFを使用します。[サーフェスの作成] ツールを使用して、デコンボリューションされた神経信号の周囲にサーフェスを作成し、チェックされていないスムージング機能、しきい値の絶対強度、しきい値の下限 3,000、上限しきい値 65,535 を選択します。サーフェスは 10 ボクセル以上に保ちます。

神経サーフェスの編集タブを使用して単一の非神経サーフェスを選択するか、Controlキーを押しながら複数の非神経サーフェスを選択して、非神経サーフェスを削除します。選択した非神経面は、削除ボタンを押して削除します。神経表面の編集タブを使用し、マスクプロパティのすべてマスクボタンを押します。

新しいウィンドウで、[チャンネル] 選択で [チャンネル 5 ミトコンドリア デコンボリューション] を選択し、マスクを適用する前にチャンネルの重複をチェックします。内側外側を一定にするラジオボタンを押し、設定されたボクセルの外側サーフェスを0.0にします。そしてOKボタンを押します。

最後に、サーフェスの作成ツールを使用してミトコンドリア特異的サーフェスを作成し、オフの Smooth 機能を選択し、しきい値に Background Subtraction を使用して、マスクされたデコンボリューション ミトコンドリア シグナルの周囲にサーフェスを作成します。最大の球の直径を 1.50 マイクロメートルに設定し、下限しきい値を 2,000 に、上限しきい値を最大 65,535 に設定します。サーフェスは必ず 1.0 ボクセル以上に保ちます。