マウス網膜錐体光受容体におけるカルシウム動態モニタリングのための2光子顕微鏡法

メンブレンマウントマウス網膜組織を含むカバーガラスを2光子顕微鏡下に置きます。

組織は、錐体光受容体で FRET ベースのカルシウム バイオセンサーを発現します。

水浸対物レンズを使用して、組織に焦点を合わせます。

背景照明の下では、錐体軸索終末は脱分極したままになり、カルシウムの流入が可能になります。

細胞内カルシウム結合はバイオセンサーのコンフォメーションを変化させ、ドナーとアクセプターの蛍光色素を近づけます。

2光子イメージングを開始します。

顕微鏡のレーザーは、低エネルギーの近赤外光を組織に集束させます。

レーザーの焦点では、2 つの光子が同時にバイオセンサーを励起し、ドナーからアクセプターへのエネルギー伝達を引き起こします。

これにより、アクセプターの蛍光が増加し、ドナーの蛍光が減少します。

蛍光比を計算します。

次に、光刺激を与えて錐体を過分極させ、細胞内カルシウムレベルを下げます。

これにより、バイオセンサーのコンフォメーションが元に戻り、ドナーからアクセプターへのエネルギー伝達が阻害され、蛍光比が低下します。

応答を記録して、錐体軸索終末における光誘発カルシウムダイナミクスを分析します。

スライスを保持チャンバーから記録チャンバーに移し、すぐに炭酸素化細胞外溶液で灌流を開始します。記録チャンバー内の灌流流量は毎分 2 ミリリットル、温度は摂氏 37 度に維持します。20倍、0.95 NAの水浸対物レンズとCCDカメラを、記録チャンバーの下にある赤外線LEDと組み合わせて使用して、網膜スライスの位置を特定します。

製造元の指示に従って、2光子イメージングシステムを起動します。次にレーザーをオンにして860ナノメートルに設定します。ECFPとシトリンの蛍光イメージング用の2つの検出チャネルをオンにします。次に、画像取得ソフトウェアを使用して、2光子顕微鏡を制御してスキャンし、記録するコーン端子の列を選択します。画像取得を 128 x 16 ピクセルの画像または同様の構成に設定します。

スキャン領域をコーン端子に限定して、外側のセグメントの光色素の漂白を防ぎます。レーザーをオンにします。光刺激を提示するか、薬理学的薬剤を適用する前に、錐体が走査レーザーと刺激の背景光に20〜30秒間適応するのを待ちます。次に、任意の刺激の提示を開始します。刺激は、カスタマイズされたソフトウェアによって制御されるマイクロプロセッサボードを使用して、2つのLEDの強度を時間の経過とともに変調することによって生成されます。次に、それぞれの画像取得ソフトウェアを使用して、2つの蛍光チャンネルの記録を同時に開始します。