ゼブラフィッシュ網膜再生中のMuller Glial核遊走のライブセルイメージング

トランスジェニックゼブラフィッシュからのアガロース包埋背側網膜外植片から始めて、培地を含むフッ素ディッシュにマウントします。

網膜は光誘発性光受容体損傷を示し、GFPを発現する核を持つミュラーグリア細胞またはMGCを含んでいます。

皿を多光子顕微鏡チャンバーに入れます。

明視野照明を使用して、網膜に焦点を合わせます。

蛍光モードに切り替えて、MGCを見つけます。

神経節細胞層またはGCLから外側の核層またはONLへのzスタックを設定します。

ライブイメージングを開始します。

損傷した光受容体はTNF-αを放出し、MGCを活性化します。

MGC核は、DNAを複製するために、内核層またはINL内で基底移動します。

次に、核は頂端にONLに移動して有糸分裂を起こし、ニューロンの前駆細胞を生成します。

有糸分裂後、MGC核と前駆細胞は基礎的に移動してINLに戻ります。

駆細胞は増殖し、損傷部位に移動し、光受容体に分化し、網膜の再生を可能にします。

キャプチャされた画像を解析して、核の移動を可視化します。

画像取得ソフトウェアで、A1 MP GUI、TiPad、A1 Compact GUI、ND取得ウィンドウを開きます。多光子イメージングの場合は、A1 Compact GUIウィンドウでIR NDDオプションが選択されていることを確認してください。次に、設定フィールドで、最初のダイクロイックミラーにIR-DMを選択し、バンドパスフィルターが525〜50に設定されていることを確認して、GFP蛍光を取得します。

次に、A1 MP GUIウィンドウでIRレーザーのスイッチを入れます。レーザーの準備が整うまでに数分かかります。その後、波長を910ナノメートルに設定してGFP蛍光を励起し、[自動位置合わせ]ボタンをクリックしてレーザーを位置合わせします。

網膜培養物を多光子顕微鏡ステージに置いた後、光電子増倍管の露出オーバーを避けるために、シャッターを開く前に部屋と機器の照明がオフになっていることを確認してください。騒音レベルを下げるには、顕微鏡を暗い環境に保管してください。

エリアウィンドウで設定したズーム2で300×300ピクセルの視野と、A1コンパクトGUIウィンドウで選択したピクセル滞在時間4.8マイクロ秒の画像を取得します。A1 MP GUIウィンドウの取得領域とA1 Compact GUIウィンドウのゲインを変更して、レーザー出力を大まかに設定します。

次に、神経節細胞層に焦点を合わせ、ND取得ウィンドウ内のZサブウィンドウにZスタックの上部焦点面を設定します。内核層の対応する細胞と比較して丸く拡大した薄暗く標識されたGFAPおよびGFP陽性細胞の存在を特徴とする外核層のレベルを通して焦点面を移動させます。

この平面を Z スタックの最下部として設定します。次に、zステップサイズを0.7〜1マイクロメートルに設定します。Z 強度補正を設定するには、[Z 強度補正] ウィンドウを開き、[ND から] を選択して Z スタック範囲を設定します。次に、[Z 強度補正] ウィンドウの下部焦点面をクリックし、レーザー強度とゲインを設定します。

その後、Z Intensity Correction ウィンドウの z 値の横にある矢印をクリックして、選択した焦点面の Z Intensity Correction ウィンドウの Device Settings の下に表示される設定を確認します。中間面と上面の平面に対してこのプロセスを繰り返し、レーザー出力とゲインを増加させます。

A1 MP GUIウィンドウで取得領域を設定し、イメージングの開始時に15より大きい取得領域と126より高いゲインを選択して、光退色やノイズレベルの増加を回避します。続いて、Z 強度補正ウィンドウで相対強度補正を選択します。ND取得ウィンドウの時系列サブウィンドウで、期間を8時間に、間隔を遅延なしに設定します。次に、[ND Acquisition] ウィンドウの [Z-Stack] サブウィンドウで [Run Z Correction] をクリックして、3D 時系列