Name: 核磁気共鳴分光法を用いた環境メタボロミクスのための低密度プランクトンコミュニティからの代謝物の濃度 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: 学ぶ 核磁気共鳴分光法を用いた環境メタボロミクスのための低密度プランクトンコミュニティからの代謝物濃縮・抽出法。フィルター処理、凍結乾燥、水溶性代謝物抽出の手順を解説し、微生物群集の代謝プロファイル解析に活用できます。

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この研究は、文部科学、技術、日本省から探索研究（JK）に挑戦するための科学研究費補助金、および科学研究（A）（JKとSM）によって部分的にサポートされていました。理研FPRフェローシップ（RCE）は、追加サポートを提供。著者は、博士に感謝の意を表明する。英資近山、NMRおよび統計分析と技術支援のための恭代​​関山と真美岡本。

1。溶出物を削除するフィルタの準備<ol><li> 25 mm径0.22μmの孔サイズデュラポアPVDF親水性フィルター（ミリポア社製）を使用します。ピンセットを使用してクリーン500ミリリットルパイレックスビーカー内のフィルタを配置します。蒸留水で3回プレリンス。あなたがお互いにくっつくのフィルターを防ぐために、リンスとしてよく渦。 300ミリリットルのMilli-Q（ミリポア社製）または同等の高品質の水を追加します。フィルタからの溶出物の完全な除去を容易にするためにオートクレーブします。 </li><li>のMilli-Qとこの時間は、ミリQを捨て、再びトリプルフィルターをすすぎます。清潔で乾燥した表面（例えば、アルミ箔など）との合理的な温度（例えば37°C）または空気乾燥のいずれかで乾燥した上でピンセットの場所の個々のフィルタを使用する。フィルタが現在使用することができます。 </li></ol> 2。サンプル材料のろ過<ol><li>このプロトコルは、ガラスをサポートし、25 mmの微量分析フィルタの列を持つミリポアステンレス鋼3の場所フィルタマニホールドを立証するためのと機械式ポンプが使用されています。無菌テクニックを使用して、フィルターカラムをベースにシングル25mmのフィルタを配置し、列を適用し、一緒にクランプします。 </li><li> 、カラムに試料15mlを読み込むフィルタマニホールドにストップバルブを開き、ポンプの電源をオンにします。セルの破損（&lt;5 kPa）を最小限に抑えるために穏やかな圧力下でフィルタリングします。そのような手や蠕動ポンプのような他のポンプは、このプロトコルに適合させることができる。低密度のサンプルについては、水の連続的な追加が必要になることがあり、フィルターは水の添加の間に長時間の乾燥行かせません。 </li><li>あなたがサンプルを濾過した後、海洋試料については、あなたは、オプションの淡水は、サンプルでは、​​フィルタ上の残留常磁性イオンを低減するためにリンスを実行できます。これは、分光器の磁石のより正確なチューニングに役立つことがあります。単に穏やかに少量の水を追加し、末尾に採取した試料を介してフィルタリングします。 </li><li>フィルタリングが完了すると、ポンプの電源をオフにし、バルブのOPEを残すnは、フィルタの下の負圧が残っている。クランプとフィルタ列を削除します。 </li><li>片手で、フィルタのホールドを取るためにきれいなピンセットを使用しています。自分自身を越えてフィルタを折るが、しわません。もう一方の手でフィルターを保持するために無菌の2 mlマイクロチューブのリップを使用しています。フィルタの両方のエッジを再つかむためにそれらを使用してピンセットを離します。倍に45°の角度でRegrip。 </li><li>それは内側に面した試料側で開きますので、2 mlチューブとリリースにフィルタを配置します。あなたは、無菌の2 mlのマイクロチューブにこのように2つまでのフィルタを配置することができます。二つのフィルターを使用している場合、彼らはできるだけ少し重なるようにします。すぐに（少なくとも-30℃）凍結。 </li></ol> 3。水性の水溶性代謝物の抽出<ol><li>一晩または少なくとも10時間あなたのサンプルを凍結乾燥。 </li><li>凍結乾燥後、各チューブ（Tokken）にステンレス製の粉砕機を追加します。 750μlの標準化カリウムを追加します。38.3 mMのKH 2 PO 4、61.7 mMのK 2 HPO 4、DSS 0.1; 2,2 -ジメチル-2 - silapentane-5-スルホネート（DSS）、標準（KPIに重水素酸化物のリン酸塩のNMRバッファ（2 H&gt; 90％） mMのは、pH 7.0、90％D 2 O）2。 </li><li>フィルタから細胞物質を除去するために4℃の水超音波でC（断片化、Diagenodeの）で5分間のサンプルを超音波処理してください。きれいなピンセットでフィルタを削除します。 </li><li> 5分間のミル粉砕機（1600 rpm）を用いて細胞を破壊する。 </li><li> 15分間のベンチトップシェーカー（エッペンドルフ）に（1400 rpm）で振とうしながら65℃でインキュベートします。 </li><li>きれいなピンセットで金属製のブタを外し、5分間13,000 gでサンプルを遠心します。 </li><li> NMR分光法のNMRチューブに直接上清を描画します。 </li></ol> 4。 NMR分光法とデータ解析<ol><li> （ここでは、ブルカーDRX-500分光計を搭載したNMR分光計にサンプルをロードするXWIN-NMRを実行するコンピュータによって制御されるトリプル軸勾配とTXIプローブ）。 </li><li> XWIN-NMRインターフェースから適切な以前に発行されたメソッドの2,15を使用して 1D 1 H NMRスペクトルを取得します。本研究では1 H NMRスペクトルは、1.2秒の繰り返し時間で、ウォーターゲートパルスシーケンスによって抑制された298 K.残留水信号で500.03 MHzでDRX-500分光器オペレーティング·システム上で記録した。 128過渡は、スペクトルごとに32,000データポイントを取得するために集められた。 </li><li> PCにインストールNMRPipeソフトウェア16にNMRデータディレクトリを転送します。生データを処理し、0ppmでの参照は、手動でスペクトルを相としてDSSを設定します。デジタル化し統合するか"ビニング"それらをそのようなrNMR、Automicsとしてソフトウェアを使用して、またはECOMICSのWebサイト（から公的に利用可能なFT2Bパッケージを使用して、離散的な値の集合にスペクトルデータ<a href="https://database.riken.jp/ecomics/">https://database.riken.jp/ecomics/</a> ）3,17。番目の例であり、スペクトルはECOMICSを使用して0.032 ppmの積分領域上0.5〜10.5 ppmの間で統合し、DSSまたは全信号強度のいずれかに正規化された。出力データは現在のようなR 18のようなフリーソフトウェアパッケージを使用して主成分分析（PCA）などの下流の統計分析に使用することができます。 </li></ol> 5。代表的な結果 1 H NMRスペクトルの例としては、上記の方法は、 図1に示されている使用して得られた。これらのサンプルは、小宇宙実験の2つの時点から、藻類の代謝活動に起因する明確な違いを示しています。 4日目スペクトルは、1日目のサンプルに比べて、特に3から4 ppmの範囲で、ピークのかなりの豊かさを示しています。これらのピークは、小宇宙の中で珪藻ブルーミングによって生成された糖に起因することができます。人工または天然海水中の天然プランクトン群集の成長を比較して同様の実験では、統計的アプローチのローディングプロットは、スペクトル内のピークを識別することができますがビンのNMRスペクトルから派生した主成分分析（PCA）スコアプロットとしてUCHは、二つの治療法（図2）の間に明確な代謝の違いを示すために使用することができ、その形状データの配布。このような結果はこのようなゲノムフィンガープリント法（図3）から、他のオミクスレベルからのデータと比較することができます。これらのNMRピークは（BMRB時など、個別に照会することができます<a href="http://www.bmrb.wisc.edu/">http://www.bmrb.wisc.edu/</a> ）19、またはスペクトル全体（例えばでSpinAssignと統計的に分析することができます<a href="http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search">http://prime.psc.riken。 JP /？アクション= nmr_search</a> ）2。この例では、治療の違いは、自然のプランクトンコミュニティの代謝物からのスペクトルの糖地域のピークの豊富（3.39 ppmから4.04 ppm）のによるものであったし、人工海水のコミュニティに特有のいくつかのピークが暫定的にIDEだったSpinAssignを使用して乳酸とギとしてntified。 <img src="/files/ftp_upload/3163/3163fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1は、この手順を使用して処理したサンプルから得られた代表的な1 H NMRスペクトルを示す。小宇宙のサンプルは前に（1日目）と（4日目）強烈な珪藻ブルーム時に撮影された。 NMR実験は、内部標準のピーク高さ（; 0 ppmのDSS）に正規化信号とブルカーDRX-500で行われた。 <img src="/files/ftp_upload/3163/3163fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2自然と小宇宙で育った天然由来の微生物プランクトンコミュニティ（オープンダイヤモンド）や人工的な（黒丸）海水のメタボロームから選別NMRスペクトルの主成分分析（PCA）スコアプロット。明確な代謝の違いは、散布図で観察することができます。このような分析からロードプロットは、その後の重要性の明確なピークを識別するために使用することができますシステムは、必要に応じて、これらのピークは、さらに分析することができます。 <img src="/files/ftp_upload/3163/3163fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3マルチオミックス解析の例としては、ゲノムデータとNMRを組み合わせた。変性勾配ゲル18Sの電気泳動（左）と16Sに基づいて、コミュニティの構成（右） 図2に、分析と同じ試料からのrRNA遺伝子は、天然（オープンダイヤモンド）と人工（黒丸）海水の小宇宙の間に明確な微生物群集のパターンを示しています。自然のシステムからメタボロームやゲノムとの間のこのような対応は、このアプローチの有用性を示しています。

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</ol>

利害の衝突が宣言されません。

ここで示したろ過及び代謝物抽出法は、NMRメタボロミクスのために十分な量で収集する微生物プランクトンのバイオマスが可能になります。 KPIと1D 1 H NMRを用いて水性の水溶性代謝物の抽出のみが実証されていますが、他の抽出溶媒と分光の手法を使用することができます。一つの有用な例は、異種のサンプルから優れたNMRスペクトルを生成するために示され、常磁性イオンによる汚染に敏感であるなどの海洋試料15で発見された半極性溶媒として重水素化メタノールを使用することである。このような場合には、上記抽出物からのペレットは、連続抽出のために保持する必要があります。我々の以前の作品は、インキュベーション時間と温度とNMR分光法15,20の直接の水抽出の適合性の下でのスペクトルの安定性を示している。しかし、研究者はまた、ディー·エヌ·エーを使用することによって、例えば、抽出工程を変更するのを好むかもしれませんチューリングは、抽出前に酵素を不活性化するステップ、または急速な焼入れをここに示すように、単に細胞を凍結する異なる方法を使用します。さらに、ここで紹介する方法は最高の、治療間の代謝産...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> 0.22μmの親水性デュラポアPVDFフィルター、25ミリメートル</td><td>ミリポア</td><td> GVWP02500 </td><td></td></tr><tr><td>微量分析フィルターホルダー、25ミリメートル、フリットガラスのサポート</td><td>ミリポア</td><td> XX1002500 </td><td></td></tr><tr><td> 3位マニホールド、47ミリメートル、ステンレス鋼</td><td>ミリポア</td><td> XX2504735 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td>埼玉県和光市</td><td> 169から04245 </td><td></td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 </td><td>埼玉県和光市</td><td> 164から04295 </td><td></td></tr><tr><td>重水、2 H&gt; 90％ </td><td> Campridge同位Laboratoties </td><td> DLM-4 </td><td></td<html> &gt; </tr><tr><td> DSS </td><td>フルカ</td><td> 92754 </td><td></td></tr><tr><td> Automill </td><td> Tokken </td><td> TK-AM4 </td><td>含まれているステンレス製の粉砕機</td></tr><tr><td>サーモ快適さ</td><td>エッペンドルフ</td><td> 5355 000.011 </td><td></td></tr><tr><td>断片化</td><td> Diagenodeの</td><td> UCD-200 </td><td></td></tr><tr><td>真空蒸発装置</td><td> EYELA </td><td> CVE-3100 </td><td></td></tr><tr><td> NMR </td><td>ブルカー</td><td> 5ミリメートル-TXIプローブを用いたDRX-500 </td><td></td></tr><tr><td>スペクトルビニングツール</td><td>独自に開発した</td><td> FT2DB </td><td> <a href="https://database.riken.jp/ecomics/">https://database.riken.jp/ecomics/</a> </td></tr><tr><td>代謝物のアノテーションツールとデータベース</td><td>独自に開発した</td><td> SpinAssign </td><td>= nmr_search &quot;&gt; http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search </td></tr></tbody></table>

核磁気共鳴分光法を用いた環境メタボロミクスのための低密度プランクトンコミュニティからの代謝物の濃度

Concentration of Metabolites from Low-density Planktonic Communities for Environmental Metabolomics using Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

環境メタボロミクスは生物に対応し、生化学的なレベル1の環境と相互に作用する方法に新たな理解を推進している新興分野である。核磁気共鳴（NMR）分光法は、このような研究のためにかなりの約束で、ガスクロマトグラフィー - 質量分析（GC-MS）を含むいくつかの技術の一つです。 NMRの利点は、非標的分析に適した構造情報を提供し、スペクトルは個々の代謝物のスペクトル2,3の最近使用可能なデータベースに対して、定量的および統計的方法で照会することができますということです。さらに、NMRスペクトルデータは、互いに分類群の生理的応答と環境4,5,6のより包括的な理解を提供するために、他のオミクスレベル（例えばトランスクリプトミクス、ゲノミクス）からのデータと組み合わせることができます。しかし、NMRはAPにそれが難しく、他のメタボローム技術よりも感度が低いです。サンプル集団はそのような全体の組織、生体液または細胞培養物として明確に定義され、容易に抽出可能な情報源からの代謝物に比べて低い低密度及び代謝物濃度になります自然の微生物のシステムへのプライ。その結果、現在までに行われた微生物のいくつかの直接的な環境メタボローム研究はそのようなホスト·シンビオント·システムなどのカルチャベースまたは容易に定義されている高密度の生態系、安定同位体標識をすることができます腸内環境の共培養または操作建設に限られてきたさらに、NMR信号7,8,9,10,11,12を強化するために使用されます。 NMRに適した濃度で、環境の代謝物の濃度と回収を容易にする方法は、不足している。最近の関心は多くのエネルギーと物質の流れがプランクトンコミュニティ13,14によって媒介される水生環境内の生物の環境へのメタボロミクスに与えられているので、濃度のための方法を開発しましたるとろ過による浮遊微生物のシステムからの全コミュニティの代謝物の抽出。市販の親水性ポリ-1,1 - difluoroethene（PVDF）フィルタは、特別に完全にそうでなければ、その後の分析で汚染物質として現れることができる抽出物を除去するために扱われます。これらの処理のフィルタは、興味のある環境や実験サンプルをフィルタリングするために使用されています。湿潤試料材料を含むフィルターを凍結乾燥し、水、水溶性代謝物は、標準化されたリン酸カリウム抽出緩衝液2を使用して、従来のNMR分光法のために直接抽出されます。これらのメソッドから派生したデータは統計的に意味のあるパターンを識別するために分析、またはコミュニティと生態系の機能の包括的な理解のための他のオミクスレベルで統合することができます。

微生物のプランクトンコミュニティからの代謝物抽出のための方法が示されています。コミュニティ全体のサンプリングが特別に用意されたフィルター上にろ過することにより達成される。凍結乾燥後、水性の水溶性代謝物が抽出されます。このアプローチは、自然または実験的な微生物群集のトランスオミクス研究への環境メタボロミクスの応用が可能になります。

環境メタボロミクスは、生物が環境にどのように反応し、また互いにどのように相互作用しているかについての新たな理解を促進する、新興の分野である。

核磁気共鳴（NMR）分光法は、環境メタボロミクス研究においていくつかの明確な利点を提供しますが、本手順においては感度が比較的低いという課題があります。ここでは、NMRに適したプランクトン系からの全コミュニティメタボライトの濃縮および抽出のためのろ過法を報告します。これは、まず抽出物を除去してサンプル収集用のフィルターを特殊に準備することによって達成されます。手順の第2段階では、天然または実験的なサンプルをフィルターでろ過します。第3段階では、サンプル材料を液状化し、代謝物を抽出します。手順の最終段階では、核磁気共鳴分光法を用いてサンプルを分析し、適宜データを統合します。最終的に、メタボロミクスおよびtransamsアプローチを通じて、環境勾配に沿った天然試料における代謝変化や、実験的な操作に対する反応を示す結果を得ることができます。遠心分離などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、コミュニティ全体をサンプリングでき、低密度の試料に対してより大きなサンプル量を扱うことが可能である点です。この手法は、微生物の増殖が環境変化にどのように反応するかなど、環境金属混合物分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。本手順の実演は、私の研究室にて行われます。ピンセットを用いて、清潔な500 milliliterのPyrexビーカーにフィルターを入れ、本プロトコルを開始します。フィルターが互いに付着するのを防ぐため、蒸留水を加えてフィルターを浸し、よく撹拌して予備洗浄を行います。水を捨て、この洗浄操作を2回繰り返します。最終洗浄後、ビーカーに 300 milliliters の Milli Q 水を加え、フィルターをオートクレーブで滅菌します。フィルターのオートクレーブ滅菌が完了したら、Milli Q 水を捨て、前述と同様に 3 回洗浄します。ただし、ここでは Milli Q 水を使用してください。個々のフィルターを、ピンセットを用いて、適温で乾燥させたアルミホイルなどの清潔で乾燥した表面に配置します。例えば、37°Cで乾燥させるか、風乾させます。これで、本プロトコルの実演に使用するフィルターの準備が完了しました。無菌操作を用い、ガラス支持体付きの25 mmマイクロアナリシスフィルターカラムを備えたMillipore製ステンレス製3連フィルターマニホールドとメカニカルポンプを使用します。25 millimeterのフィルター1枚をフィルターカラムのベースに設置します。カラムを取り付け、装置をクランプで固定します。高栄養分マイクロコスムから得られたサンプル15 millilitersをカラムにロードします。フィルターマニホールドのストップバルブを開き、細胞の破壊を最小限に抑えるため、緩やかな圧力でポンプフィルターを起動します。低密度サンプルの場合は、水を段階的に添加する必要があるかもしれません。その際、水の添加間隔が開いてフィルターが長時間乾燥した状態にならないよう注意してください。次に、海洋試料から残留常磁性塩を除去し、必要に応じて淡水でのリンスを行います。ろ過が完了したら、ポンプの電源を切り、フィルターに負圧が維持されるようバルブを開けたままにします。片手でクランプとフィルターカラムを取り外します。清潔なピンセットを使用してフィルターをつかみます。もう一方の手でフィルターを折り畳みますが、折り目はつけないようにしてください。滅菌済みの2 mLマイクロ遠心チューブの縁を使用して、フィルターを固定します。フィルターを2 mLチューブに入れ、サンプル側が内側を向くようにして離します。水溶性代謝物を抽出するため、直ちに液体窒素で凍結させます。まず、サンプルを凍結乾燥させ、その後一晩または少なくとも10時間放置して室温に戻します。各チューブにステンレス製クラッシャーを投入します。標準化されたリン酸カリウム緩衝液およびDSS標準物質を含む重水（deuterium oxide）を750 µL加えます。フィルターから細胞物質を除去するため、ウォーターバスソニケーターを用いて、サンプルを4°Cで5分間超音波処理します。清潔なピンセットでフィルターを取り出します。ミルクラッシャーを用いて1600 RPMで5分間、細胞を破砕します。次に、65 °Cでインキュベートします。その後、ベンチトップシェーカーで15分間振盪させます。インキュベーション後、清潔なピンセットで金属製クラッシャーを取り出します。サンプルを13,000 Gで5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を吸い取り、NMR分光法用にNMRチューブへ直接移します。ここにサンプルをNMR分光計にロードします。サンプルは、298 Kelvinで動作し、トリプルアクシスグラジエントを備えたTXIプローブを搭載したBruker DRX 500分光計を用いて測定します。磁場のロック、チューニング、およびシミングを行います。TopSpinインターフェースおよび既述の手法を用いて1DプロトンNMRスペクトルを取得するか、必要に応じて他の分光計インターフェースソフトウェアを利用します。本スペクトルは、Watergateパルスシーケンスを用いて残留水信号を抑制し、繰り返し時間1.2秒で取得しました。今回の例では、各サンプルについて128回のトランジェントを収集しました。NMRデータを、NMR pipeソフトウェアがインストールされたパーソナルコンピュータに転送します。生データを処理し、DSSシグナルを0 PPMの参照点として設定した後、手動でスペクトルの位相補正を行います。eCommerceウェブサイトから入手可能な公開パッケージであるFT two Bを用いて、スペクトルデータをビン化しデジタル化します。RNMRやAtomicsなどの他のソフトウェアユーティリティをbin.Binに使用することもできます。データは、サンプル間の比例的な信号変化を示すために、合計信号またはDSS信号で正規化することができます。出力されたデータは、図に示すようなRなどのフリーソフトウェアパッケージを用いた主成分分析（PCA）などの後続の統計解析に使用可能です。以下は、実演した手順を用いて得られたプロトンNMRスペクトルの例です。これらのスペクトルは、マイクロコスム実験の2つの時点から得られたものであり、藻類の代謝活性による明確な差異を示しています。4日目のスペクトルでは、1日目のサンプルと比較して、特に3から4:00 PMの範囲においてピークがかなり豊富に現れています。これらのピークは、マイクロコスム内で増殖した珪藻によって生成された糖に起因すると考えられます。同様の実験において、Mr.Spectraのbendから得られた、最初の2つの主成分を示すPCAスコアプロットを用いて、人工海水および天然海水における天然プランクトン群集の増殖を比較しました。この統計的手法により、多次元データがより簡潔な形式（ここでは2次元）に集約され、基礎となるデータポイントの近接性による構造が単純に明らかにされます。ここでは、どちらか一方または両方の軸がより類似しています。2つの処理間で明確な代謝上の違いが見て取れます。この実験から得られたデータは、マルチオミクス解析に使用されました。NMRをゲノムデータと組み合わせ、18Sおよび16S rRNA遺伝子の変性勾配ゲル電気泳動に基づくコミュニティ組成を解析した結果、天然海水と人工海水のマイクロコスム間で、異なる微生物コミュニティパターンが示されました。天然系におけるメタボロームとゲノムのこのような対応関係は、本アプローチの有用性を証明しています。この手順を試みる際は、手順後のコンタミネーションを最小限に抑えるため、適切な手法を用いることが重要です。マイクロバイオームが特定の代謝物とどのように相関しているかなど、さらなる疑問に答えるために、オミクスレベルでの解析などの他の手法を実施することができます。

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核磁気共鳴分光法を用いた環境メタボロミクスのための低密度プランクトンコミュニティからの代謝物の濃度

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