核磁気共鳴分光法を用いた環境メタボロミクスのための低密度プランクトンコミュニティからの代謝物の濃度

核磁気共鳴（NMR）分光法は、環境メタボロミクス研究においていくつかの明確な利点を提供しますが、本手順においては感度が比較的低いという課題があります。ここでは、NMRに適したプランクトン系からの全コミュニティメタボライトの濃縮および抽出のためのろ過法を報告します。これは、まず抽出物を除去してサンプル収集用のフィルターを特殊に準備することによって達成されます。

手順の第2段階では、天然または実験的なサンプルをフィルターでろ過します。第3段階では、サンプル材料を液状化し、代謝物を抽出します。手順の最終段階では、核磁気共鳴分光法を用いてサンプルを分析し、適宜データを統合します。

最終的に、メタボロミクスおよびtransamsアプローチを通じて、環境勾配に沿った天然試料における代謝変化や、実験的な操作に対する反応を示す結果を得ることができます。遠心分離などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、コミュニティ全体をサンプリングでき、低密度の試料に対してより大きなサンプル量を扱うことが可能である点です。この手法は、微生物の増殖が環境変化にどのように反応するかなど、環境金属混合物分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。本手順の実演は、私の研究室にて行われます。

ピンセットを用いて、清潔な500 milliliterのPyrexビーカーにフィルターを入れ、本プロトコルを開始します。フィルターが互いに付着するのを防ぐため、蒸留水を加えてフィルターを浸し、よく撹拌して予備洗浄を行います。水を捨て、この洗浄操作を2回繰り返します。

最終洗浄後、ビーカーに 300 milliliters の Milli Q 水を加え、フィルターをオートクレーブで滅菌します。フィルターのオートクレーブ滅菌が完了したら、Milli Q 水を捨て、前述と同様に 3 回洗浄します。ただし、ここでは Milli Q 水を使用してください。

個々のフィルターを、ピンセットを用いて、適温で乾燥させたアルミホイルなどの清潔で乾燥した表面に配置します。例えば、37°Cで乾燥させるか、風乾させます。これで、本プロトコルの実演に使用するフィルターの準備が完了しました。無菌操作を用い、ガラス支持体付きの25 mmマイクロアナリシスフィルターカラムを備えたMillipore製ステンレス製3連フィルターマニホールドとメカニカルポンプを使用します。

25 millimeterのフィルター1枚をフィルターカラムのベースに設置します。カラムを取り付け、装置をクランプで固定します。高栄養分マイクロコスムから得られたサンプル15 millilitersをカラムにロードします。

フィルターマニホールドのストップバルブを開き、細胞の破壊を最小限に抑えるため、緩やかな圧力でポンプフィルターを起動します。低密度サンプルの場合は、水を段階的に添加する必要があるかもしれません。その際、水の添加間隔が開いてフィルターが長時間乾燥した状態にならないよう注意してください。

次に、海洋試料から残留常磁性塩を除去し、必要に応じて淡水でのリンスを行います。ろ過が完了したら、ポンプの電源を切り、フィルターに負圧が維持されるようバルブを開けたままにします。片手でクランプとフィルターカラムを取り外します。

清潔なピンセットを使用してフィルターをつかみます。もう一方の手でフィルターを折り畳みますが、折り目はつけないようにしてください。滅菌済みの2 mLマイクロ遠心チューブの縁を使用して、フィルターを固定します。

フィルターを2 mLチューブに入れ、サンプル側が内側を向くようにして離します。水溶性代謝物を抽出するため、直ちに液体窒素で凍結させます。まず、サンプルを凍結乾燥させ、その後一晩または少なくとも10時間放置して室温に戻します。各チューブにステンレス製クラッシャーを投入します。

標準化されたリン酸カリウム緩衝液およびDSS標準物質を含む重水（deuterium oxide）を750 µL加えます。フィルターから細胞物質を除去するため、ウォーターバスソニケーターを用いて、サンプルを4°Cで5分間超音波処理します。清潔なピンセットでフィルターを取り出します。

ミルクラッシャーを用いて1600 RPMで5分間、細胞を破砕します。次に、65 °Cでインキュベートします。その後、ベンチトップシェーカーで15分間振盪させます。

インキュベーション後、清潔なピンセットで金属製クラッシャーを取り出します。サンプルを13,000 Gで5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を吸い取り、NMR分光法用にNMRチューブへ直接移します。

ここにサンプルをNMR分光計にロードします。サンプルは、298 Kelvinで動作し、トリプルアクシスグラジエントを備えたTXIプローブを搭載したBruker DRX 500分光計を用いて測定します。磁場のロック、チューニング、およびシミングを行います。

TopSpinインターフェースおよび既述の手法を用いて1DプロトンNMRスペクトルを取得するか、必要に応じて他の分光計インターフェースソフトウェアを利用します。本スペクトルは、Watergateパルスシーケンスを用いて残留水信号を抑制し、繰り返し時間1.2秒で取得しました。今回の例では、各サンプルについて128回のトランジェントを収集しました。

NMRデータを、NMR pipeソフトウェアがインストールされたパーソナルコンピュータに転送します。生データを処理し、DSSシグナルを0 PPMの参照点として設定した後、手動でスペクトルの位相補正を行います。eCommerceウェブサイトから入手可能な公開パッケージであるFT two Bを用いて、スペクトルデータをビン化しデジタル化します。

RNMRやAtomicsなどの他のソフトウェアユーティリティをbin.Binに使用することもできます。データは、サンプル間の比例的な信号変化を示すために、合計信号またはDSS信号で正規化することができます。出力されたデータは、図に示すようなRなどのフリーソフトウェアパッケージを用いた主成分分析（PCA）などの後続の統計解析に使用可能です。

以下は、実演した手順を用いて得られたプロトンNMRスペクトルの例です。これらのスペクトルは、マイクロコスム実験の2つの時点から得られたものであり、藻類の代謝活性による明確な差異を示しています。4日目のスペクトルでは、1日目のサンプルと比較して、特に3から4:00 PMの範囲においてピークがかなり豊富に現れています。

これらのピークは、マイクロコスム内で増殖した珪藻によって生成された糖に起因すると考えられます。同様の実験において、Mr.Spectraのbendから得られた、最初の2つの主成分を示すPCAスコアプロットを用いて、人工海水および天然海水における天然プランクトン群集の増殖を比較しました。この統計的手法により、多次元データがより簡潔な形式（ここでは2次元）に集約され、基礎となるデータポイントの近接性による構造が単純に明らかにされます。

ここでは、どちらか一方または両方の軸がより類似しています。2つの処理間で明確な代謝上の違いが見て取れます。この実験から得られたデータは、マルチオミクス解析に使用されました。

NMRをゲノムデータと組み合わせ、18Sおよび16S rRNA遺伝子の変性勾配ゲル電気泳動に基づくコミュニティ組成を解析した結果、天然海水と人工海水のマイクロコスム間で、異なる微生物コミュニティパターンが示されました。天然系におけるメタボロームとゲノムのこのような対応関係は、本アプローチの有用性を証明しています。この手順を試みる際は、手順後のコンタミネーションを最小限に抑えるため、適切な手法を用いることが重要です。

マイクロバイオームが特定の代謝物とどのように相関しているかなど、さらなる疑問に答えるために、オミクスレベルでの解析などの他の手法を実施することができます。