遺伝子発現を評価するためのマウス脊髄における軟膜下遺伝子送達

麻酔をかけたマウスを取り、背中を剃り、皮膚を消毒します。

皮膚を切開し、椎骨から筋肉を剥がし、クランプを使用して引っ込めます。

椎弓板にドリルで穴を開けて亀裂を作り、骨片を取り除いて硬膜(脊髄の外膜)を露出させます。

針を使用して、硬膜開口部を作成し、下にある軟膜に穴を開けて軟膜下腔に入り、脊髄組織に直接アクセスします。

蛍光タンパク質発現遺伝子を運ぶ組換えアデノ随伴ウイルスの懸濁液を含むデリバリー針を取り、懸濁液を注入します。

針を抜き、筋肉と皮膚を縫合し、マウスを回復させます。

ウイルスはニューロンやグリア細胞の受容体に結合し、エンドサイトーシスを受けます。

核内に入ると、ウイルスは遺伝子発現を引き起こして蛍光タンパク質を生成します。

軟膜下遺伝子送達モデルは、脊髄における標的遺伝子発現を評価する準備が整いました。

手術のために動物を適切に麻酔することから始めます。ここではイソフルランが使用されています。続行する前に、足を挟む反応がないことを確認してください。次に、眼科用軟膏で目を覆います。次に、バリカンで動物の背中を剃り、2%クロルヘキシジンで皮膚をきれいにします。

腰椎軟膜下注射を行う場合は、メスでT8からL1椎骨を覆う皮膚を切断します。次に、はさみを使用して傍脊椎筋をT10からT12の脊椎から切り離します。マウス脊椎クランプを使用して、動物を標準的な定位固定フレームに取り付けます。次に、歯科用ドリルを使用して、T10 から T12 椎骨の椎板の両側を亀裂が現れるまで剃ります。

次に、鉗子を使用してひびの入った骨片を取り除き、腰椎脊髄の背側表面を露出させます。硬膜が見えるようになりました。30ゲージのステンレス鋼の針を使用して、硬膜に1〜2ミリメートルの切開を行います。

下にある軟膜への損傷を避けるために、硬膜を慎重に切り開くことが重要です。

次に、鉗子で切断した硬膜の端をつかみ、硬膜の開口部を最大5ミリメートル延長します。ガラスキャピラリーホルダーを使用して、34ゲージの軟膜貫通針と36ゲージの注射針を2つの別々のXYZマニピュレーターのZアームに取り付けます。

次に、PE-10またはPE-20チューブに接続された50マイクロリットルのマイクロシリンジを使用して、AAV9-UBI-GFPウイルスをロードします。ウイルスがロードされたら、チューブの端を注射針に接続します。次に、倍率8〜10倍に設定された外科用解剖スコープを通して見ながら、Xアームを使用して軟膜貫通針を軟膜に1ミリメートルの深さまで下げます。貫通針の角度を組織表面に対して5〜10度に保ちます。

軟膜を開いた後、Xアームを使用して軟膜下腔から軟膜貫通針を取り外します。血管などのランドマークを使用して、貫通した部位に注意してください。2番目のマニピュレーターのX、Y、およびZアームを動かして、AAV9ウイルスをロードした注射針の先端を軟膜浸透部位に配置します。

次に、注射針の先端を軟膜下腔に約0.5ミリメートル挿入した後、Zアームを使用して軟膜を約0.3ミリ持ち上げ、次にXアームを使用して針を軟膜下腔に水平に進め続けます。針が約2〜3ミリメートルの深さで軟膜下腔に入るまで

針を前進させます。

次に、50マイクロリットルのマイクロシリンジを使用して、AAV9-UBI-GFPウイルスを軟膜下腔に注入します。AAV9-UBI-GFP注射が完了したら、軟膜下腔から注射針を取り外します。フルオロモノフィラメント縫合糸と外科用クリップを使用して筋肉と皮膚を閉じます。清潔なケージに収容する前に、動物を加熱パッドで回復させます。