のAlexa Fluor ®標識を通じてデング熱ウイルスの可視化
2011年7月9日
蛍光体の開発とイメージング技術、ウイルスはウイルスと細胞の間で早期に相互作用を視覚化するために考案されたデング熱ののAlexa Fluor ®標識の簡単な方法の進歩を活用して。
この実験の全体的な目的は、顕微鏡研究のためにデング熱ウイルスを蛍光標識することです。必要なバッファーを準備し、ショ糖クッションでデングウイルスを精製し、Amy React、Alexaフロー染料、デングウイルスをラベリングバッファーに再構成します。デング熱ウイルスを100マイクロモルのAlexaフローで標識します。
1時間死滅させ、サブ試薬で標識反応を停止します。ラベル dengue virus をサイズ除外列で精製します。プラークアッセイにより標識されたウイルスを再生成し、免疫蛍光アッセイにより標識の程度を推定します。
こんにちは、私はDSO国立研究所のSam Jangで、NUSの大学院医学部卒業後、新興感染症のプログラムでDr.Weeの研究室で働いています。今日は、イメージング研究のためにAmy Reactive Alexaインフルエンザ染料でDenkiウイルスを蛍光標識する方法を紹介します。アレクサ、インフルエンザは、安定性に優れており、フルオレセインやルーミンタスクなどの一般的な食事よりもpH感受性が低いため、ウイルスの細胞取り込みとエンドソーム輸送に関する研究に最適です。
デング熱ウイルスとラベル付けされたAlexaの欠陥は、デング熱の病因の理解を促進します。それでは始めましょう。標識反応の前に、新しい標識緩衝液を調製し、書かれたプロトコルに従って試薬を停止し、ショ糖クッションでデングウイルスを精製し、精製したデングウイルスの適量をマイクロ遠心チューブ内の標識緩衝液に加えて、1ミリリットルあたり3億形成単位の濃度を達成します。
これは比例してスケールアップできます。ウイルスのバッチラベリング用。凍結乾燥したAlexaフロア染料を、標識反応の直前に標識バッファーで1ミリモルに再構成します。
このステップ以降は、光への露出を最小限に抑えます。デモンストレーションの目的で、Alexa床染料は、1ミリモルの800マイクロリットルの光から保護されないままになります。Alexaは、マイクロピペットチップで優しく攪拌しながら、希釈したデングウイルスに流れます。
1時間後、15分ごとに穏やかな反転によって混合された光から保護された室温で1時間インキュベートし、チューブを短時間遠心分離します。800マイクロリットルのサブ領域をマイクロピペットで優しく見つめながら、室温でさらに1時間インキュベートします。光から保護され、15分ごとに穏やかな反転によって作られます。
その間、精製カラムは25ミリリットルのHNEバッファーと同等です。1時間のインキュベーション後、標識ウイルスをカラムに適用し、フロースルーの収集を開始します。列に Hne バッファーを埋め込みます。
すべての標識ウイルスがマトリックスに入ったら、最初の2.5ミリリットルのフロースルーを廃棄し、標識されたウイルス画分の次の2ミリリットルを収集します。エコルと精製された標識ウイルスを摂氏マイナス80度で観察しました。プラークアッセイにより標識ウイルスの表題を決定します。
一般的な実験では、ウイルスのタイトルの10倍未満の減少が観察されるはずです。標識後、標識の程度を評価するために免疫蛍光アッセイを実施する必要があります。これを行うには、ヘモサイトメーターを使用してウイルス細胞を列挙し、適切な量の細胞を増殖培地にして、ミリリットルあたり50, 000個の細胞の密度を達成します。
滅菌ガラスカバーを含む4ウェルプレートにウェルあたり1ミリリットルのウイルス細胞を入れてください。寝る。細胞を摂氏37度で一晩、5%二酸化炭素とインキュベートします。インキュベーターからプレートを取り出し、実際には、標識されたウイルスの約1つのMOIを持つ細胞を100マイクロリットルの容量で摂氏37度で10分間
吸引します。Inoculumを取り出し、ウェルあたり0.5ミリリットルのPBSバッファーで細胞を洗浄します。スピリットディスとこの手順をさらに2回繰り返します。細胞を200マイクロリットルの3%/ウェルで室温で30分間固定します。
ウェルあたり0.5ミリリットルのPBSバッファーで細胞を3回洗浄します。細胞を化溶液で室温で30分間Alizeします。カバーを取り外し、細かい鉗子を使用してよく眠ります。
カバーの端をDPして、余分な液体を排出します。白い紙に滑りつけます。カバーのセル側を置きます。
パルファムに25マイクロリットルのデング熱Eタンパク質抗体を乗せて眠ります。湿度の高いチャンバー内で、光から保護された室温で1時間インキュベートします。次に、カバースリップを6ウェルプレートに移し、オイルごとに2ミリリットルの洗浄バッファーを追加します。
仰臥位を吸引します。最後の洗浄後、これらの洗浄手順をさらに2回繰り返します。ファインfpを使用してカバースリップをウェルから取り外します。
カバーの端を浸して、余分な液体を排出します。紙のワイプに滑り込ませます。カバーのセル側を置きます。
25マイクロリットルのAlexaフロアで眠り、香水に88個の抗マウス二次抗体を塗布します。インキュベーションが完了した後、光から保護された室温の湿ったチャンバーで45分間インキュベートし、カバースリープを6ウェルプレートに移し、細胞を2ミリリットルの洗浄バッファーで3回洗浄します。最後の洗浄後の各洗浄について、ウェルからカバースリップを取り外し、イオン化された水で1回すすいでください。
紙に浸して余分な水分を排出します。カバースリップを8マイクロリットルのマイルドな取り付け溶液で顕微鏡ライトに拭き取ります。取り付けソリューションが一晩の空気を摂氏4度に設定するようにします。
これで、サンプルを蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡で視覚化する準備が整いました。カバースリープの表面に少量の浸漬油を注ぎ、顕微鏡を固定します。顕微鏡ステージにスライドします。
顕微鏡の対物レンズが液浸油に接触するまでステージを調整します。クララル画像の場合は、Zes Zenソフトウェアを使用してアンビエントライトをオフにしてください。接眼タップをクリックすると、顕微鏡の接眼レンズを通してサンプルを直接観察できます。
セルで埋め尽くされているセルを見つけて、フォーカスを調整します。次に、取得モードに切り替えます。花の滝の間のクロストークを最小限に抑えるには、Alexa floor 4 8 8とfinite fourのトラックを別々に選択します。
色素とセット取得をシーケンシャル励起および検出に。レーザーパワーゲインとオフセットを調整して、画像が露出オーバーまたは露出アンダーにならないようにします。画像をキャプチャし、共局在機能を使用して関心のある領域を分析します。
オーバーラップ係数は、Alexa Flo Dyeによるデングウイルスの標識の程度を推定するために使用できます。簡単な免疫蛍光アッセイをウイルス細胞で行い、標識の程度は、標識されたウイルスの共局在から推定できます 抗eタンパク質では、抗抗体染色の重複係数は0.65〜0.8の範囲であり、分散の約65〜80%がAlexaフロア染料で標識されたことを示唆しています。ラベリング手順を成功させるには、ラベリングバッファーを準備し、新たに荒れ狂い始め、ラベリング前にAlexaフロアダイジェストを再構成することが重要です。
使用する染料の濃度は、お客様のニーズに合わせてさらに最適化することができます。デング熱ウイルスをホライズンで標識するこの方法は、他のウイルスの標識にも適応できる可能性があります。というわけで、これだけです。
ご覧いただきありがとうございます、そしてラベリング実験の頑張ってください。
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概要
この研究では、顕微鏡分析のためにAlexa Fluorを使用してデングウイルスを蛍光標識する方法を提示しています。この方法により、ウイルスと宿主細胞の間の初期の相互作用を視覚化することができます。
主要な研究要素
科学の分野
- ウイルス学
- 蛍光顕微鏡法
- 細胞生物学
背景
- デングウイルスは世界的な健康問題です。
- ウイルスと細胞の相互作用を理解することは、抗ウイルス戦略の開発に不可欠です。
- 蛍光標識はこれらの相互作用の視覚化を強化します。
- 画像技術の進歩により詳細な研究が可能になります。
研究の目的
- デングウイルスを標識するための信頼性の高い方法を開発すること。
- デングウイルスと宿主細胞の間の相互作用を視覚化すること。
- ウイルス感染の初期段階の理解を深めること。
使用された方法
- 標識に必要なバッファーの調製。
- スクローズクッションを使用したデングウイルスの精製。
- 標識バッファーにおけるAlexa Fluor染料の再構成。
- 特定の濃度の染料でウイルスを標識すること。
主な結果
- デングウイルスの成功的な蛍光標識。
- 顕微鏡下でのウイルスと細胞の相互作用の視覚化。
- 免疫蛍光アッセイによる標識効率の評価。
- プラークアッセイによる標識ウイルスの再滴定。
結論
- この方法はデングウイルスを標識するための簡単で効果的な方法を提供します。
- 蛍光標識はウイルスと宿主の相互作用の研究に役立ちます。
- この技術は他のウイルス研究にも適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Direct fluorescent labeling of dengue virus with Alexa Fluor enables precise visualization of virus-cell interactions, supporting early-stage mechanistic studies in infectious disease research. This capability enhances predictive confidence in target validation and informs translational strategies for antiviral and vaccine development. The method's compatibility with live virus and quantitative imaging strengthens its value across discovery and preclinical inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of virus entry and trafficking mechanisms in host cells.
- Supports biological de-risking by clarifying early infection events relevant to pathogenesis.
- Facilitates functional target validation through visualization of labeled virus interactions.
- Improves predictive confidence for downstream therapeutic hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized approach for preparing fluorescently labeled virus for imaging-based assays.
- Ensures reproducibility and quantitative assessment of labeling efficiency via immunofluorescence and plaque assays.
- Enables scalable batch labeling suitable for high-content screening platforms.
- Supports reliable evaluation of antiviral compound effects on virus-cell entry and trafficking.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by preserving virus infectivity post-labeling.
- Enables continuity from mechanistic discovery to preclinical validation of intervention strategies.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing quantitative imaging readouts.
- Facilitates biomarker alignment through colocalization analysis of viral and cellular markers.
Pipeline & Workflow Integration
This labeling method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting hypothesis-driven studies, assay development, and translational research on viral pathogenesis.
- Discovery Biology: Advances mechanistic understanding of virus-host interactions through direct visualization and quantitative colocalization.
- Screening: Delivers reproducible, labeled virus preparations for imaging-based screening of antiviral candidates.
- Analytics: Provides quantitative outputs such as overlap coefficients and infectivity titers for comparative analysis.
- Translational Research: Maintains functional virus for use in disease-relevant cellular models and biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly adaptable protocol for labeling other enveloped viruses in diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in early-stage virology research.
- Operational Value: Standardizes virus labeling and imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation by enabling robust target validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of antiviral and vaccine candidates based on quantitative imaging data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in virology, fluorescence microscopy, and quantitative image analysis.
- Needs access to high-quality imaging platforms and analytical software for colocalization studies.
- Demands rigorous buffer preparation and dye handling to ensure reproducibility and minimize cytotoxicity.
- Adaptable to other enveloped viruses with protocol optimization for specific viral systems.
- Dependent on maintaining virus viability and labeling efficiency for downstream applications.
