のAlexa Fluor ®標識を通じてデング熱ウイルスの可視化

この実験の全体的な目的は、顕微鏡観察のためにデングウイルスを蛍光標識することです。必要な緩衝液を調製し、スクロースクッションを用いてデングウイルスを精製し、標識緩衝液中でAmy React Alexa flow dyeとデングウイルスを再構成します。100 µMのAlexa flowを用いてデングウイルスを標識します。

1時間インキュベートし、サブ試薬で標識反応を停止させます。サイズ排除カラムを用いて標識したデングウイルスを精製します。プラークアッセイによって標識ウイルスの力価を再測定し、免疫蛍光法を用いて標識率を推定します。

こんにちは。私はNUS大学院医学研究科を卒業し、現在はDSOナショナルラボラトリーズのWee博士の研究室で新興感染症プログラムに従事しているSam Jangです。本日は、イメージング解析のために、Amy Reactive Alexa flu dyeを用いてデングウイルスを蛍光標識する方法を説明します。Alexa flu dyeは、フルオレセインやローダミンなどの一般的な染料よりも安定性に優れ、pHの影響を受けにくいため、ウイルスの細胞内取り込みやエンドソーム輸送の研究に最適です。

Alexa Fluor標識デングウイルスを用いることで、デングウイルスの病原性の解明が進みます。それでは、手順を開始しましょう。標識反応の前に、記載されたプロトコルに従って新鮮な標識緩衝液と停止剤を準備し、ショ糖クッション法でデングウイルスを精製します。精製したデングウイルスを適切な量、マイクロ遠心チューブ内の標識緩衝液に加え、濃度を300 million forming units per milliliterに調整します。

これは比例してスケールアップすることが可能です。ウイルスのバッチラベル化を行う場合、ラベル化反応の直前に、凍結乾燥されたAlexa floor dyeをラベル化バッファーを用いて1 mMに再構成してください。

これ以降のステップでは、光への曝露を最小限に抑えてください。デモンストレーション目的のため、Alexa flow dyeの一部は遮光せずに操作します。マイクロピペットチップで穏やかに撹拌しながら、1 mMのAlexa flow dyeを800 µL、希釈したデングウイルスに加えてください。

室温にて、遮光条件下で1時間インキュベートし、15分ごとに緩やかに転倒混和させます。1時間後、チューブを短時間遠心分離します。マイクロピペットで緩やかに撹拌しながら、サブリージョンの溶液800 µLを分注し、室温にてさらに1時間インキュベートします。この際、遮光し、15分ごとに緩やかな転倒混和を行ってください。

その間に、精製カラムを25 millilitersのHNEバッファーで平衡化します。1時間のインキュベーション後、ラベル付けしたウイルスをカラムに適用し、フロースルーの回収を開始します。その後、カラムをHNEバッファーで満たします。

ラベル化されたウイルスのすべてがマトリックスに進入したら、最初の2.5 millilitersのフロースルーを廃棄し、続いてラベル化ウイルス画分の2 millilitersを回収します。精製したラベル化ウイルスを-80 °Cで保存します。プラークアッセイにより、ラベル化ウイルスのタイターを決定します。

典型的な実験では、ウイルス価の低下は10倍未満であるはずです。ラベル化後、ラベル化の程度を評価するために免疫蛍光アッセイを実施します。そのためには、血球計数器を用いてウイルス細胞数を算出し、細胞密度が50,000 cells per milliliterになるように、適切な量の細胞を増殖培地に加えてください。

4ウェルプレートの各ウェルに、滅菌済みのガラスカバーとともにウイルス細胞を1 mLずつ分注します。37 °C、5% CO2条件下で細胞を一晩インキュベートします。プレートをインキュベーターから取り出し、各ウェルから上清を吸引除去します。その後、100 µLの容量で約1 MOIの標識ウイルスを細胞に加え、37 °Cで10分間静置します。

接種液を除去し、1ウェルあたり0.5 millilitersのPBSバッファーで細胞を洗浄します。この操作をさらに2回繰り返します。室温で、1ウェルあたり200 microlitersの3%パラフォルムアルデヒドを用いて30 Minutesの間、細胞を固定します。

各ウェルにつき0.5 millilitersのPBSバッファーで細胞を3回洗浄します。室温で固定液を用い、30 Minutesの間、細胞を固定します。精密ピンセットを使用して、ウェルからカバーガラスを取り除きます。

カバーの端を吸い取り紙で押さえ、余分な液体を取り除きます。吸水紙の上で滑らせるようにして、カバーの細胞側を配置します。

パラフィン上の25 µLのデングウイルスeタンパク質抗体の上にスライドグラスを載せます。遮光した室温の湿潤チャンバー内で1時間インキュベートします。次に、カバーガラスを6ウェルプレートに移し、1ウェルあたり2 mLの洗浄バッファーを加えます。

上清を吸引します。最後の洗浄後、さらに2回これらの洗浄ステップを繰り返します。微細ピンセットを用いて、ウェルからカバーガラスを取り除きます。

カバーの端を浸して余剰な液を排出します。ペーパーワイプで拭き取ります。カバーのセル側を設置します。

パラフィルムの上に、Alexa Fluor 488抗マウス二次抗体25 µLを分注します。遮光した状態で、室温の加湿チャンバー内で45分間インキュベートします。インキュベーション完了後、カバーガラスを6ウェルプレートに移し、1回につき2 mLの洗浄バッファーを用いて細胞を3回洗浄します。最後の洗浄後、ウェルからカバーガラスを取り出し、イオン水で1回すすぎます。

ペーパーに吸い込ませて余剰な液体を除去します。8 µLの弱 mounting solution を用いて、カバーガラスを顕微鏡標本に封入します。封入剤を 4 °C の環境下で一晩静置し、固着させます。

サンプルは、蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡での観察が可能な状態になりました。カバーガラスの表面に浸漬油を少量滴下し、スライドを顕微鏡ステージに固定してください。

顕微鏡の対物レンズが浸液に接するまでステージを調整します。鮮明な画像を得るために、Zes Zenソフトウェアを使用して周囲の照明を消します。接眼レンズを通してサンプルを直接観察するには、ocularタブをクリックしてください。

細胞を含む視野を探し、フォーカスを調整します。次に、イメージングモードに切り替えます。蛍光チャンネル間のクロストークを最小限に抑えるため、Alexa Fluor 488とCy5にそれぞれ個別のトラックを選択してください。

染料を順次励起および検出に設定します。画像が露出オーバーまたは露出不足にならないよう、レーザー出力のゲインとオフセットを調整してください。画像をキャプチャし、共局在化（colocalization）機能を用いて関心領域を解析します。

オーバーラップ係数を用いて、Alexa Flo Dyeによるデングウイルスの標識度を推定できます。ウイルス細胞に対して簡便な免疫蛍光アッセイを行い、標識されたウイルスと抗Eタンパク質抗体染色の共局在から標識度を推定したところ、オーバーラップ係数は0.65から0.8の範囲となり、約65%から80%のウイルス粒子がAlexa Flo Dyeで標識されていることが示唆されました。標識手順を成功させるためには、標識バッファーを調製し、新鮮な試薬を使用し、標識前にAlexa Flo Dyeを再構成させることが重要です。

使用する染料の濃度は、ニーズに合わせてさらに最適化することが可能です。このデングウイルスのホライゾンラベル法は、他のウイルスのラベル付けにも応用できる可能性があります。以上です。

ご視聴ありがとうございました。ラベリング実験の成功をお祈りいたします。