DNAメチル化：重亜硫酸修飾と分析

この手順の全体的な目的は、重亜硫酸塩変換DNAのゲノムシーケンシングにより、CpGジヌクレオチドのDNAメチル化解析を可能にすることです。これは、まず二本鎖DNAを変性させ、重亜硫酸塩変換反応が行われるようにすることで達成されます。次のステップでは、重亜硫酸塩脱アミノ化により、ゲノムDNA内のすべての非メチル化シトシンをウラシルに変換します。

この反応は3つの段階で進行します。第1段階では、シトシン残基の5位と6位の二重結合にB亜硫酸塩が添加され、硫酸エステル化が起こります。第2段階では、亜硫酸誘導体によるシトシンの加水分解的脱アミノ化により、亜硫酸誘導体によるSSLが生成されます。そして第3段階として、アルカリ処理によってスルホン酸基が除去されることで、SSL残基となります。

次に、重亜硫酸塩変換特異的プライマーとPCR増幅によって標的領域を増幅させます。最終ステップは、PCR産物のクローニングとシーケンシングであり、これによりDNA分子全体のメチル化を単一塩基レベルの解像度で解析します。最終的に、酸性条件下での重亜硫酸塩脱アミノ化に対するシトシンと5-メチルシトシンの感受性の差を利用することで、ゲノムDNAにおけるCpGジヌクレオチドのDNAメチル化が示されます。

サザンブロット法などの既存の手法に対する本技術の主な利点は、DNAメチル化を単一ヌクレオチド分解能で解析できる点にあります。この手法は、癌などのヒト疾患におけるDNAメチル化の役割など、エピジェネティクス分野における重要な課題の解決に寄与します。重亜硫酸塩変換のためのDNAサンプルを調製するには、まず2 µgのゲノムDNAを、重亜硫酸塩およびDNA溶解バッファーと共に、全量18 µLとなるように混合し、37 °Cで1時間インキュベートします。

次に、新鮮に調製した3 M 水酸化ナトリウムを最終濃度0.3 Mになるよう2 µL添加し、ゲノムDNAを変性させます。サンプルをウォーターバスで37 °Cで15分間インキュベートし、続いて90 °Cで2分間インキュベートします。ヒートブロックから取り出し、直ちにチューブを氷上で5分間静置します。10,000 ×gで10秒間遠心分離し、DNAがチューブの底に集まっていることを確認します。これで変性DNAサンプルが準備され、次に実演するB細胞の脱アミノ化に使用可能となります。

硫酸化学反応および加水分解脱アミノ化反応の前に、10 millimolarのキノリールおよび飽和亜硫酸水素ナトリウム溶液（pH 5.0）を新しく調製します。亜硫酸水素ナトリウムは飽和溶液であるため、小さな塊が未溶解のまま残る場合があります。変性DNA 20 µLに対し、亜硫酸水素ナトリウム 208 µLおよびキノリール 12 µLを加え、最終容量を240 µLにします。

チューブをボルテックスし、10秒間遠心分離して、すべての液滴がチューブの底に集まるようにします。サンプルの上にミネラルオイルを重ねます。変換するDNAの量と品質に応じて、ウォーターバスを用いて55 °Cで4〜16時間インキュベートします。

酸化を防ぐため、重亜硫酸塩変換は暗所で行うことが重要です。適切なインキュベーション時間が経過した後、マイクロ遠心機でチューブを短時間遠心し、すべての液体がチューブの底に集まっていることを確認します。次に、ミネラルオイルを吸い込まないように注意しながら、チューブの底からDNA溶液を慎重にピペットで吸い出します。

次のステップでは、当研究室ではPromega Wizard DNAクリーンアップシステムを使用します。DNAサンプルに1 mLのレジンを加え、チューブを反転させて混合し、その後、脱塩カラムに取り付けたシリンジに溶液をピペッティングします。最後に、遊離した亜硫酸イオンを除去するため、亜硫酸処理したDNAを脱塩カラムに通し、50 µLのMilli Q水で溶出します。

次のステップは、脱塩によってウラシル環から重亜硫酸塩を脱離させることです。これを達成するために、重亜硫酸塩処理した各DNAサンプルに、最終濃度が0.3 molarになるよう、調製直後の3 molar 水酸化ナトリウムを5.5 microliters添加します。その後、サンプルを37 degrees Celsiusで15分間インキュベートします。

サンプルを短時間遠心分離し、各サンプルに1 µLのTRNAを添加します。酢酸アンモニウムを最終濃度3 Mとなるように添加し、溶液を中和します。次に、エタノール沈殿によりDNAを回収します。

氷冷した100%エタノールを330 µL加え、転倒混和して十分に混ぜ合わせます。－20 °Cで1時間から一晩静置した後、4 °Cで14,000 ×g、15分間遠心分離します。次に、上清を完全に除き、沈殿したDNAを約20分間風乾させます。

風乾後、ペレットはほとんど目視できません。DNAペレットを50 µLの0.1 XTEまたは水で再懸濁し、室温で約2時間静置します。この間、時々チューブをボルテックスしてDNAが完全に溶解していることを確認し、その後、短時間遠心分離を行います。DNAが溶解したら、DNAの量と質に応じて-20 °Cで1～10年間保存するか、すぐに使用することができます。PCR増幅において、プライマーの最適化はこの手順の中で最も困難な部分です。

したがって、プライマー設計を成功させるためのガイドラインを以下に示します。これらのガイドラインを説明するために、標的配列を亜硫酸塩で変換しており、変換されたシトシンは青色のTとして、未変換のCpGサイトは赤色のcgとして表示されています。特異性を確保するため、プライマーの長さは24から30塩基対にする必要があります。また、プライマーの予測Tm値は50 °C以上で同程度であり、その差が1〜2 °C以内である必要があります。

変換の特異性を確保するため、プライマーには約25%のCからTへの置換塩基を含める必要があります。3'末端の最終塩基は、変換されたD-N-A-C-P-Gジヌクレオチドの増幅を確実にするためにCからTとする必要があります。メチル化、非メチル化、または未変換のテンプレートに対する潜在的なバイアスを避けるため、プライマー配列内でのCPGジヌクレオチドは避けるべきです。ただし、不可避な場合は、変換されたDNAのバイアスのない増幅を確実にするため、CPG部位のシトシンをYに置き換えてください。

最後に、必要に応じてPCR反応の特異性または感度を確保するために、ネステッドプライマーまたはセミネステッドプライマーセットを設計します。最適化のため、25 µLずつのPCR増幅反応混合液を調製します。各反応には、亜硫酸塩変換したゲノムDNA、DPSプライマー、塩化マグネシウム、塩化カリウム、トリス塩酸塩 pH 8.3、および Taq ポリメラーゼを含め、メチル化または非メチル化物質の増幅バイアスを検証します。

ビサルファイト変換後の比例的PCR増幅を確認するため、メチル化および非メチル化DNAを50:50の割合で混合し、完全にビサルファイト変換させたコントロールサンプルを使用します。特異的プライマーとPCR反応液を準備し、温度勾配サーモサイクラーを用いて、プライマーのTm値から±3°Cの範囲で8〜10本のチューブにわたる勾配反応を設定します。チューブをボルテックスし、サーモサイクラーにセットする前にマイクロ遠心機で短時間スピンダウンさせます。この図は、50%メチル化および非メチル化DNAの混合物から得られた、温度勾配PCR増幅プロファイルのアガロースゲル電気泳動の結果を示しています。

PCR増幅産物およびTと記された2、5、8番目のレーンは、メチル化DNAのみを消化する制限酵素で処理されています。最適なPCR増幅条件であれば、メチル化および非メチル化増幅産物をバイアスのなく比率通りに増幅し、ここに見られるように、切断されたPCR産物と未切断のPCR産物が同量得られるはずです。バイアスのない増幅のための最適なサーモサイクリング条件は55.6 °Cです。重亜硫酸塩処理DNAの完全な変換は、未変換DNAのみを消化するシトシン部位特異的酵素を用いた消化により、3、6、9番目のレーンで解析できます。

ここでは、3つのレーン（レーン3、6、9）すべてで切断されたDNAが見られないことから、完全な重亜硫酸塩DNA変換が行われたことが示されています。このリアルタイム解離プロットでは、完全メチル化DNA（ピンク色の線M）と非メチル化DNA（緑色の線U）がそれぞれ82.9 °Cおよび86.9 °Cで解離するコントロールの増幅に対し、メチル化DNAと非メチル化DNAが等量ずつ含まれる50:50混合物（赤オレンジ色の線）が同等の割合で示されています。これは、異なる分子が解離する温度に基づいた増幅バイアスが存在しないことを示しています。

重亜硫酸塩処理したサンプルの増幅によって得られたPCRフラグメントは、アガロースゲル電気泳動で可視化し、シーケンシングすることが可能です。ここに、3つの異なる細胞株からのシーケンス波形を示します（CpG部位を黄色でハイライトしています）。細胞株Xは3つのCpG部位すべてで100%のメチル化を示していますが、細胞株YおよびZでは、ここに示されるGAシグナルの重複からわかるように、さまざまな程度のメチル化を示しています。図4Aは、CpG部位を黄色でハイライトした3つの異なる細胞株のシーケンス波形です。

個々のクローンのダイレクトシーケンシング後、個々の分子のメチル化状態を重亜硫酸塩マップに表形式でまとめることができます。メチル化の不均一性を視覚化するため、個々のCpG部位におけるメチル化密度を赤色で示しています。この代表的な重亜硫酸塩マップは、サンプルのハイスループット定量メチル化分析を示しています。

sequenome epi typer技術を用いることで、図5Aに示す例のように、メチル化シトシンの有無に依存した特異的なスペクトルを得ることができます。その後、サンプル内の比率の要約をエピグラムとして外挿することができ（図5B）、この例では4つの異なる細胞株における各CpGサイトのDNAメチル化率が示されています。最終的に、エピグラムの作成後にメチル化プロット要約図（図5C）を導き出すことができます。この手法は、エピジェネティクス分野の研究者がDNAメチル化およびそれがヒトの疾患に果たす役割を探索するための道を切り開きました。