DNAメチル化：重亜硫酸修飾と分析

この手順の全体的な目標は、亜硫酸塩変換DNAのゲノムシーケンシングにより、CPGジヌクレオチドのDNAメチル化分析を可能にすることです。これは、最初に二本鎖DNAを変性させることによって達成され、バイサルファイト変換反応が起こる可能性があります。第2のステップは、バイサルファイト脱アミノ化によってゲノムDNA中のすべての非メチル化シトシンをウラシルに変換することです。

この反応には3つのフェーズがあります。1つ目は、ファイブシックスダブルボンドにBサルファイトを付加することによるシトシン残基のサルフェーションです。第二に、亜硫酸誘導体によるシトシンの水和脱アミノ化により、亜硫酸誘導体によるSSLが生成され、第三に、アルカリ処理によるスルホン酸基の除去により、SSL残留物が生じる。

次に、標的領域を重亜硫酸塩変換特異的プライマーとPCR増幅によって増幅します。最後のステップは、PCR産物のクローニングとシーケンシングを行い、DNA分子全体のメチル化のための単一ヌクレオチド分解能を得ることです。最終的に、結果は、酸性条件下での二硫酸脱アミノ化に対するサイトカインの感度の増加と5つのメチルシトシンを利用したゲノムDNAのDNAメチル化を示しています。

この手法は、南部血液分析などの既存の方法に対する主な利点として、dメチル化の単一ヌクレオチド分離を可能にすることができます。この方法は、がんなどのヒト疾患におけるDNAメチル化の役割など、エピジェネティクス分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。重亜硫酸塩変換用のDNAサンプルを調製するには、まず、2マイクログラムのゲノムDNAを重亜硫酸塩、DNA溶解バッファー、および総容量18マイクロリットルと摂氏37度で1時間インキュベー

次に、新たに調製した3モルの水酸化ナトリウムを2マイクロリットル添加して、最終濃度0.3モルまでゲノムDNAを変性させます。サンプルを摂氏37度で水浴中で15分間インキュベートし、続いて摂氏90度で2分間インキュベートします。ヒートブロックでは、すぐに5分間氷上にチューブを置き、10秒間チューブを遠心分離して10,000GsでDNAがチューブの底にあることを確認し、変性DNAサンプルは次に実証されるB細胞の戦いの脱アミノ化の準備ができています。

硫酸化および加水分解脱アミノ化反応の前に、10ミリモルキノールと飽和メタナトリウムの新鮮な溶液を亜硫酸塩pH5.0で調製します。亜硫酸ナトリウムメタは飽和溶液であるため、小さな塊が溶解しないままになる場合があります。亜硫酸塩208マイクロリットルとキノール12マイクロリットルによるメタナトリウムを変性DNA20マイクロリットルに240マイクロリットルの最終体積で追加します。

チューブをボルテックスし、10秒間遠心分離して、すべての液滴がチューブの底にあることを確認します。サンプルに鉱油を重ねます。サンプルを摂氏55度のウォーターバスで4〜16時間インキュベートします(変換するDNAの量と質によって異なります)。

酸化を避けるために、バイサルファイト変換が暗闇で行われることが重要です。適切なインキュベーション時間が終了したら、マイクロ遠心分離機でチューブを短時間回転させ、すべての液体がチューブの底にあることを確認します。次に、鉱物油を一切取り込まずに、チューブの底からDNA溶液を慎重にピペットで取り出します。

次のステップとして、私たちの研究室ではpromega wizardDNAクリーンアップシステムを使用しています。DNAサンプルに1ミリリットルのレジンを加え、チューブを反転させて混合し、脱塩カラムに取り付けられたシリンジに溶液をピペットで入れます。最後に、遊離の重亜硫酸イオンを除去するために、重亜硫酸塩処理されたDNAを脱塩カラムに通し、50マイクロリットルのMilli Q水でほのめ

次のステップは、海水淡水化によってウラシルリングから重亜硫酸塩屋根裏部屋を取り除くことです。これを達成するには、新たに調製した3モルの水酸化ナトリウムを各バイサルファイト処理DNAサンプルに5.5マイクロリットル加えて、最終濃度を0.3モルにします。次に、サンプルを摂氏37度で15分間インキュベートします。

サンプルを短時間遠心分離し、各サンプルに1マイクロリットルのTRNAを追加します。酢酸アンモニウムを最終濃度の3モルまで添加して溶液を中和します。次にエタノールでDNAを沈殿させます。

氷冷、100%エタノール330マイクロリットルを加え、反転してよく混ぜます。摂氏マイナス20度で1時間放置し、摂氏4度で15分間14, 000GSで一晩遠心分離します。次に、上清の痕跡をすべて取り除き、沈殿したDNAを約20分間風乾します。

風乾後、ペレットは、DNAペレットを0.1XTEの50マイクロリットルに再懸濁するか、またはこの時間の間に約2時間室温で水放置を見ることはほとんど不可能です、時折、DNAが溶解することを確認するためにチューブをボルテックスし、その後、迅速な遠心分離機が続きます。DNAが溶解すると、DNAの量と質に応じて、摂氏マイナス20度で1〜10年間保存することも、すぐに使用することもできます。PCR増幅では、プライマーの最適化はこの手順の最も難しい側面です。

そのため、プライマー設計を成功させるために、次のガイドラインが提供されています。これらのガイドラインを説明するために、標的配列は亜硫酸塩変換されているため、書き込まれたときに変換されたシトシンは青色のTsで示され、変換されていないCPG部位は赤色のcgsとして表示されるように、プライマーは特異性を確保するために24〜30塩基対の長さである必要があります。プライマーは、摂氏50度以上で同様に予測されるTMを持ち、摂氏1〜2度以上の差がないようにする必要があります。

プライマーには、変換特異性を確保するために、約25%CからTの塩基を複数含める必要があります。変換されたD-N-A-C-P-Gジヌクレオチドの増幅を確実にするために、3つのプライムエンドがCからTであるべきという最終的な塩基は、メチル化された非メチル化または未変換のテンプレートへの潜在的なバイアスを避けるために、プライマー配列で避けるべきです。ただし、やむを得ない場合は、CPG部位のシトシンをY字型に置換して、変換されたDNAの偏りのない増幅を確保する必要があります。

最後に、必要に応じてPCR反応の特異性または感度を確保するために、ネストされたプライマーセットまたはセミネストされたプライマーセットを設計します。最適化のために、25マイクロリットルのアリコートでPCR増幅反応混合物を調製します。各反応には、亜硫酸塩変換されたゲノムDNA DPSプライマー、塩化マグネシウム、塩化カリウムトリス塩酸塩pH 8.3 anacポリメラーゼが含まれており、メチル化または非メチル化材料の増幅バイアスをテストします。

50 50 メチル化されていない非メチル化完全バイサルファイト変換コントロールサンプルを使用して、バイサルファイト変換による比例PCR増幅をテストします。温度勾配サーモサイクラー内の特定のプライマーとPCR反応混合物は、プライマーのTMから摂氏プラスマイナス3度の勾配でラン反応を8〜10本のチューブにセットし、チューブをボルテックスし、マイクロ遠心分離機で短時間回転させてからサーモサイクラーに入れます。この図は、50%メチル化DNAと非メチル化DNAの混合物からの温度勾配PCR増幅プロファイルを持つアグロスゲルを示しています。

Tレーン2、5、および8でマークされたPCRアンプリコンおよびレーンは、メチル化DNAのみを消化する制限酵素で処理されています最適なPCR増幅条件は、メチル化アンプリコンと非メチル化アンプリコンを比例してバイアスなく増幅し、ここで見られるように、カットされたPCR産物とカットされていないPCR産物が同量になります。ノンバイアス増幅の最適な熱サイクル条件は、摂氏55.6度です。亜硫酸塩DNAの完全な変換は、未変換のDNAレーン3、6、および9のみを消化するシトシン部位特異的酵素による消化によって分析できます。

完全なバイサルファイトDNA変換は、ここでは、3つのレーン、レーン3、6、および9すべてに切断されたDNAがないことによって示されています。このリアルタイムの解離プロットは、メチル化DNA赤オレンジ線50 50 50ミックスの比率が等しいことを示しています。これは、それぞれ摂氏82.9度と86.9°Cで解離する完全メチル化ピンクラインmおよび非メチル化DNA緑線Uの制御増幅と比較してです。これは、異なる分子が解離する温度に基づく増幅バイアスがないことを示しています。

重亜硫酸塩処理サンプルの増幅から得られたPCRフラグメントは、アグロスゲル電気泳動によって可視化し、シーケンシングすることができます。ここに直接示されているのは、黄色の細胞株Xで強調表示されたCPG部位が3つのCPG部位すべてで100%のメチル化を示す3つの異なる細胞株からの配列トレースであり、ここに示すGAシグナルの重なりによって見られるように、細胞株YとZはさまざまな程度のメチル化を示しています。図4Aは、CPG部位が黄色で強調表示された3つの異なる細胞株からの配列トレースです。

個々のクローンの直接シーケンシング後、個々の分子のメチル化状態をバイサルファイトマップで表にすることができます。不均一性メチル化を視覚化するために、個々のCPG部位におけるメチル化の密度を赤で示しています。この代表的なバイサルファイトマップでは、サンプルのハイスループット定量的メチル化分析を行っています。

Sequenome epi typer技術を使用すると、この例に示すように、メチル化サイトシンの存在に依存する特定のスペクトルを生成することができます。例示図5 A.サンプル中の比率の要約は、その後、エピグラムの形で外挿することができます図5B.この例は、4つの異なる細胞株の各CPG部位におけるDNAメチル化の割合を示しています。最後に、メチル化プロットの要約図5Cは、その開発後のエピグラムから導き出すことができる。この技術は、エピジェネティクスの分野の研究者がDNAメチル化とそのヒト疾患におけるその役割を探求する道を開きました。