バイオフリップチップを用いた胚性幹細胞のパターニング
2007年10月1日
我々は、基板上に所望の位置にセルを配置するための簡単な方法を示しています。このメソッドは、パターン基板上への細胞で満たされたマイクロウェルを含有するシリコーンチップを反転して細胞を。このメソッドは、セル間の拡散性とjuxtacrineシグナリングを変調する新しい方法を提供します。
私はニッケル・ミタルです。Bowman研究室の大学院生です。本日は、当研究室の元学生2名によって開発された「バイオ・フリップチップ」と呼ばれるデバイスについてお話しします。
この装置により、実験者が選択した基材上の細胞を、任意の構成で導入することが可能になります。装置自体は非常にシンプルで、こちらにあるように、基本的にはシリコン製のプレートに小さなウェルが配置された構造になっています。
各ウェルは通常、単一の細胞のみを保持するように設計されていますが、必要に応じて大きくすることも可能です。デバイスの作製において、ウェルは細胞が最終的に基板上で配置されるのと同様の配列になるようにしています。したがって、デバイス自体はソフトリソグラフィーを用いて作製されています。
具体的には、ポリジメチルシロキサンであるPDMSを使用し、それをシリコンウェハから成形します。ここにそのサンプルがあります。モールドウェハ自体は、標準的なフォトリソグラフィを用いて、シリコンウェハ上にスピンコートされたSU-8フォトレジストをパターニングして作製されます。
簡潔に言えば、バイオフリップチップのウェルに細胞を満たすことで、選択した基材上に細胞を転写します。次に、このチップを、多くの場合組織培養用ポリスチレンである選択した基材に適用します。そして最後に、この組み合わせを反転させることで、細胞がウェルから基材上へと脱落するようにします。
ステファニー・フラビンです。私はゴールドマン研究室の学部研究員で、本日は細胞パターニングを前日に行うためのバイオフリップチップの使用方法を実演します。パターニング実験を行いたいと思います。
PDMSを1インチ×1インチのガラススライドにプラズマ接合します。その後、チップのウェル側を下にしてPBS溶液に一晩浸漬させます。また、パターニング実験に使用するガスケットを切出し、同様に使用するバインダークリップを用意します。
各チップの表面に200 µLのBSAを塗布します。ピペットチップでチップ表面を軽く叩いて気泡を取り除き、BSA溶液がウェルを満たすようにします。チップをフード内で1時間放置し、通常通りUV照射装置で処理します。
1時間後、チップ上のBSA溶液を吸引し、各チップを200 µLのPBSで洗浄します。次に、10⁶ cells/mLの密度で調製した細胞懸濁液200 µLを添加します。細胞がウェルに沈殿するまで5〜10分間待ち、チップ表面をPBSで洗浄します。チップを片隅に約15度の角度で傾け、チップの下端から細胞溶液をゆっくりとピペットで回収します。
チップを水平に戻し、PBS 50 µLを上端のコーナーにゆっくりと加えます。洗浄ステップを必要回数繰り返します。チップ表面からxlsが洗浄されたら、ディッシュの内側ガスケットに培地を約50 µL加えます。
各チップの上部に培地を加えます。次に、ディッシュを反転させ、端の一角からチップの表面に傾けながら下ろします。そして、ディッシュとチップの間に気泡が形成されないように、ディッシュをチップに密着させます。
チップの両側にバインダークリップを取り付け、しっかりと固定します。チップを裏返した際にディッシュ上で水平に置かれるよう、各バインダークリップからハンドルを取り除きます。チップをインキュベーターに移動させ、不必要な動きをすべて避けながら、速やかに裏返します。
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概要
本研究では、「バイオフリップチップ」と呼ばれるデバイスを用いて、基板上に細胞を配置する新しい手法を提示します。細胞を満たしたマイクロウェルを持つシリコンチップを基板上に反転させて密着させることで、細胞の配置を効果的に制御でき、細胞間のシグナル伝達の調節を高めることが可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 細胞生物学
- 神経科学
- バイオエンジニアリング
背景
- 細胞相互作用の研究において、細胞の配置は極めて重要です。
- 現在の手法では、細胞配置の精度が不十分な場合があります。
- バイオフリップチップは、シンプルで効果的な解決策を提供します。
- この技術は、拡散性シグナリングと juxtacrine シグナリングの両方に影響を与えることができます。
研究目的
- 基質上への信頼性の高い細胞配置法を開発すること。
- 細胞シグナル伝達メカニズムへの理解を深めること。
- 様々な生物学分野の研究者にツールを提供すること。
使用方法
- バイオフリップチップの設計および作製。
- マイクロウェルへの細胞の充填。
- 目的の基板上へのチップの反転。
- 細胞の配置およびシグナリングの観察と解析。
主な結果
- 標的部位への細胞の的確な配置。
- 細胞シグナル伝達の変調効率の向上。
- 本デバイスの操作性の実証。
- さまざまな実験系における応用の可能性。
結論
- バイオ・フリップチップは、細胞配置のための革新的なツールです。
- この手法は、細胞シグナリング研究に大きな影響を与える可能性があります。
- 今後の研究により、この技術をより幅広い用途に展開することが可能です。
よくある質問
産業上の重要性
細胞集団の精密な空間制御は、幹細胞ベースの疾患モデルにおけるターゲット検証に不可欠な、拡散性および近接細胞間（juxtacrine）シグナル伝達経路の機序解明を可能にします。Bio Flip Chipは、基質に依存せず化学的性質を維持したまま定義された細胞微小環境をパターニングする手法を提供し、表現型スクリーニングのための再現性のあるアッセイ開発を支援します。このアプローチは、細胞間接触やパラクライン因子の曝露におけるばらつきを低減することで、初期探索における予測の信頼性を高め、in vitroモデルから前臨床検証へのトランスレーショナルな連続性を向上させます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期発見およびターゲット検証
- 科学的価値：局所的な細胞密度と空間的配置が、幹細胞の分化および自己複製経路にどのように影響するかという仮説検証を可能にします。
- 運用上の価値：ランダムな播種による確率的な変動を排除し、繰り返し実験間での並列分泌（juxtacrine）および傍分泌（paracrine）シグナルの入力を一定に保ちます。
- 予測的価値：標的結合研究において、接触依存性シグナリングと可溶性シグナリングの寄与を分離することで、メカニズム面でのリスク低減を支援します。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値：高コンテンツイメージングおよびマルチプレックス読み取りに対応した、定量可能で空間的に定義された細胞アレイを生成する。
- 運用の価値：基質の化学的性質を変更することなく、組織培養用ポリスチレン、ガラス、Matrigel、およびフィーダー層における細胞間相互作用アッセイの標準化を可能にする。
- 拡張性：マイクロコンタクトプリント法による細胞外マトリックスパターンの作成に対応しており、接着およびシグナル伝達の手がかりを組み合わせた制御が可能である。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 翻訳の連続性： 規定のニッチに胚性幹細胞をパターニングし、先天性疾患や再生医療に関連する発生シグナル伝達経路をモデル化します。
- 前臨床モデリング： 空間的に制御された微小環境において形態形成因子や治療薬の用量反応解析を容易にし、生理学的妥当性を向上させます。
- リスク調整後の進展： 制御されていない細胞凝集や不規則な接触頻度によるノイズを最小限に抑えることで、リード化合物同定における偽陽性を減少させます。
パイプラインおよびワークフローの統合
Bio Flip Chipは、化合物曝露前に幹細胞の再現性のあるパターニングを可能にすることで、初期探索ワークフローに統合され、リード最適化における仮説駆動型のスクリーニングおよびメカニズムの追究を支援します。
- 探索生物学：胚性幹細胞の定義された空間的組織化が、系統分化およびパスウェイ活性をどのように調節するかを検証します。
- スクリーニング：接触依存性および拡散性シグナリングに対する化合物の影響を評価するための、標準化され再現性のある細胞基質を提供します。
- 分析：パターン化された共培養における従属変数として、マーカー発現、増殖、およびアポトーシスの定量的な空間マッピングを可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：空間的に制御されたシステムでヒトの発達シグナリングカスケードをモデル化し、前臨床ターゲットの選択に役立てます。
- 企業での再利用：複数のプロジェクトにわたり、さまざまな細胞型、基質、および細胞外マトリックス構成に適応可能なモジュール式パターン形成プラットフォームとして機能します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：制御されていない細胞間相互作用による生物学的ノイズを低減し、ターゲットバリデーションの信頼性を向上させます。
- 運用上の価値：播種手法の変動に依存せず、ユーザーが定義した精密な細胞配置を可能にすることで、アッセイの再現性を確保します。
- 戦略的価値：細胞間コミュニケーションを標的とした表現型スクリーニングにおいて、S/N比を高めることで、go/no-go判断の効率を改善します。
- ポートフォリオへの影響：幹細胞介在性疾患領域における、隣接細胞間作用経路（Notch、Wntなど）のモジュレーターの、リスク調整済み優先順位付けを支援します。
実施上の検討事項
- チップの作製または調達には、ソフトリソグラフィーおよびPDMS取り扱いの専門知識が必要である。
- 基板調製のため、プラズマボンディング装置およびUV/オゾン処理へのアクセスが必要である。
- ウェルへの効率的なロードおよび放出を確実にするため、標準化された細胞調製および洗浄プロトコルが必要である。
- 3Dマトリックスやマイクロ流体システムへ適応させる場合は、反転タイミングや表面エネルギーの最適化が必要になる場合がある。
- 実用上の制限：単一細胞用に設計されたウェルに複数の細胞がロードされるのを防ぐため、ウェル占有率は細胞種およびサイズごとに経験的に決定する必要がある。
