Name: カットローディング：網膜ニューロン間ギャップ結合トレーサーカップリングの程度を調べるための便利なツール (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: 学ぶカットローディング法を用いた網膜ニューロン間のギャップ結合トレーサーカップリングの評価方法。神経ビオチンを用いて電気的シナプスの結合強度を定量化し、神経科学の研究に応用できます。

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この作品は、CPRにSCMとEY018640にNIHの助成金EY005102によって賄われていた

1。金魚、マウスおよびウサギの無傷の神経網膜の準備<ol><li>一定の周囲（背景）照明の下で説明されているものを含め、次の手順のすべて、"2）カットの読み込みを、"実行。このプロトコルの目的のために、手続きは（つまりは非常に暗い（つまり、"暗所視"）の条件で≤0.0001ルクス）をナイトビジョン赤外線ゴーグルを使用して一定の暗さにように行わ記述されているが、一定の周囲の照明の他の高強度レベルに注意してくださいギャップ結合のトレーサーのカップリングの周囲の照明の他のレベルの効果を決定する代わりに使用することができます。 </li><li>手術の前に少なくとも1時間のための実験動物（金魚、マウスまたはウサギを）暗順応。 </li><li>前述の7に記載、深くtricaineメタン（MS222;（炭酸水素ナトリウムを含む）バッファリング水槽の水の150 mg / L）をにそれらを置くことによって金魚を麻酔し、深くケタミン（100 mgとマウスを麻酔/ kgを、IP）とrompun（10 mg / kgを、IP）。深くウレタンでウサギを麻酔（負荷投与量：2.0 g / kgの、IP）とも地元の眼窩内の麻酔を（2％キシロカイン）を使用して、前述の8を説明。動物の管理と使用を含むすべての実験手順は、連邦政府のガイドラインに従って実施されるべきであると地元の大学の動物のケアと使用委員会によって審査され承認される。 （注：実験では魚、マウスやウサギの世話及び使用に伴うすべての実験手順は、NIHのガイドラインに沿って行われたとオハイオ州立大学動物実験および使用委員会によって審査され承認された、ここで説明。） </li><li>魚、マウスやウサギの場合は、摘出後に、各眼球の前方部分を削除してください。その後、ろ紙の目の後部の下になるように、眼の後部の上にろ紙片を置き、ろ紙と目を反転させる。その後、細かい使用して鉗子は、そっとろ紙に接続されている神経網膜、から、お互いに接続されている色素上皮/脈絡膜/強膜を、はげることによって眼の後部から無傷の神経網膜を細かく分析。これが行われているように、微細なバネ付きはさみを使用して視神経を切断。神経網膜、指向光受容体サイドアップは、現在、ろ紙に取り付けられており、目の残りの部分から分離する必要があります。 </li></ol> 2。カットローディング<ol><li>ある一定の周囲（背景）イルミネーション（非常に暗い（つまり、"暗所視"）の条件の下など）の下で30分間、6ウェルプレート（〜5 mLの/ウェル）の有無に関係なく酸素化リンガー溶液（ 表1）の水没は、網膜被験薬。パラフィルムで6ウェルプレートを封止することによって重炭酸塩ベース（5％CO 2 / 95％O 2）酸素リンゲル22℃での魚の網膜を維持し、36で、マウスとウサギ網膜を維持℃、5％CO 2 /のCを95％O <li>網膜を切開する直前に、リンゲル溶液でneurobiotin（0.5％）、ビオチン化分子を、溶解してトレーサー液を（通常は100μL）を用意。 0.5パーセントは、ローダミンデキストランが（高い（&gt; 10,000）MW）ソリューションに追加される可能性があることに注意してください。その高分子量のために、ローダミンデキストランは、ギャップ結合とカットによって損傷されているラベルだけのセルを越えることはありません。 図に示す。 3、これは彼らが負傷されているので、ギャップ結合を介して拡散によりトレーサーを蓄積してきたものから、neurobiotin蓄積して細胞を区別する便利な方法です。 </li><li>ガラス（またはプラスチック）ペトリ皿にneurobiotinソリューションを配置する、、過剰リンガーを削除neurobiotinソリューションで、かみそりの刃を（または他の鋭利な刃）ディップとするペーパータオルの上に網膜が添付されている濾紙を、、タップ市販nは、網膜と濾紙でラジアルカットを行います。優先の場合、スペーサはそのカットが網膜を介して行われていることではなく、濾紙を使用することができます。カットは、網膜表面に垂直に配向してください。再びneurobiotinのソリューションで、かみそりの刃を浸して網膜をもう一度カット。網膜ごとに4カット（ 図1参照 ）にこの設定を繰り返します。マウスや他の小さな網膜を通してかみそりの削減を行うときに解剖顕微鏡を使用してください。 </li><li> 図に示す。被験薬の有無にかかわらず1、新鮮なリンゲル培地で再び水没網膜を、、（5mLのリンゲル/ウェル）ウェル6プレートを使用して。ローディングと拡散を可能にするために15分間網膜をインキュベートする。 </li><li>被験薬の有無に関係なく新鮮なリンゲル培地で5分間ずつ3回洗浄する。 </li><li>室温で1時間、0.1 Mリン酸緩衝液（PBS、pH7.4）中4％パラホルムアルデヒドで網膜を修正。 </li><li>一晩4 0.1 M PBSで洗浄℃に</li><li>翌日、反応させるワットi番目の百分の二0.1M PBSでストレプトアビジン-アレクサ488（最終濃度10μg/ mLの）+ 0.3％トリトンX - 100、および4℃で一晩おく℃に</li><li>室温で10分0.1M PBSで各3回洗浄し</li><li> PBS中で、微細なブラシを使用して、次にろ紙から網膜をデタッチし、スライドの上に、網膜、指向光受容側の上に置きます。 </li><li>優しくVectashieldマウンティング培地（ベクターラボラトリーズ社、バーリンゲーム、カリフォルニア州）でマウントされます。 </li><li>の範囲で、別の実験条件（照明条件などの試験薬）の効果を比較できるように、すべての実験条件で同じ倍率、解像度と設定で共焦点顕微鏡（例えばツァイス510 META）をスキャンするレーザーを使用して撮影をするギャップジャンクショントレーサー結合した（ 図2A - C及び図4A - C）。単一のイメージが標識された細胞のすべてが含まれることもありますが、それはあなたが興味のある領域のz -スタックを収集し、単一にそれを折りたたむことをお勧めしますイメージ。 </li></li></ol> 3。 ImageJを用いてトレーサー結合の定量化<ol><li> LSMの画像ブラウザで、画像を開いて、TIF - 16ビットの圧縮されないファイルとしてエクスポート]をクリックして画像を保存します。スケールバーは、このTIF画像に含まれるべきです。 </li><li> NIH ImageJのソフトウェアを使用して、ホールマウント網膜の低倍率像からのAlexa - 488標識neurobiotinの蛍光強度を測定する。 ImageJのソフトウェアを使用してTIFファイルを開き、[スケールバーに対応する直線を引く。スケールを設定し、長さの既知の距離と単位を入力し、解析を行うに移動し、[OK]をクリックします。今すぐ測定結果は、ミリメートルキャリブレーション単位で表示することができます。 </li><li>長方形選択ツールを使用して、関心の領域を選択します。蛍光のピークは、選択枠の左側に配置する必要があります。右の境界付近には蛍光シグナルがないことを確認してください。されていない場合は、アクティブな画像（IMAGE、頭を矢印）を回転させる。 </li><li>クリックして分析し、PROFILEをプロットします。あなたは左から右に指数関数的減衰を持つカーブが表示されるはずです。 </li><li>ポップアップウィンドウでCOPYをクリックし、EXCELに貼り付けます。これではカット（左列）とカット（右列）からの距離の関数として蛍光強度から距離を示す二つの列を参照してください。 </li><li>相対蛍光強度を得るために最大蛍光値によって各生の蛍光値を割ります。 </li><li> [コピー]は、2つのカット（X）と相対蛍光強度（Y）からの距離に対応する列、およびOriginソフトウェアに貼り付ける。 </li><li>指数減衰形になっている＃1関数（。図2D及び図4D）、とのはめあい。 Y = Y 0 + Y 最大 * EXP（- X /λ） Yは相対蛍光強度である場合、Y oはバックグラウンドの蛍光であり、Y maxは最大相対蛍光であり、λはspです。エース（長さ）定数、xはカットからの距離です。 </li><li> t検定またはANOVAを（ 図2E及び図4E）を使用して、異なる実験条件で空間定数（λ）の値を比較します。定量化の代替技術が他人13,14によって記述されていることに注意してください。 </li></ol> 4。代表的な結果カットロードによって決定されるカップリング光受容体細胞トレーサーの代表的な例は、 図2及び図3（魚）と図4（ウサギ）で表示されます。共焦点画像は、比較のために、同じ設定を使用して撮影した（ 図2A - C及び図4A - C）と蛍光強度がカットからの距離の関数としてプロットし、上記の3.8号に示すように指数関数でフィッティングした（ 図2D及び図4D）。各条件のためのスペースの定数値ギャップ結合トレーサーの結合の程度がカットローディングテクニックを使用して定量することができること示す、2Eと4E図に示されています。さらに、結果は高い再現性です。ギャップ結合トレーサーの結合の程度を定量化する手段として、カットローディングテクニックの使用はまた、蛍光強度はすべてのケースでカットからの距離の関数として指数関数的に減少することを見つけることによって検証されること（また、 図を参照してください。7,8の検討neurobiotinは、他の網膜のサイトからレザーカットではなく、経由して光受容体に入ったことを示すここで2Dと4D）、。また、光受容体細胞トレーサーのカップリングで質的に類似昼/夜の違いは、シングルコーンにトレーサーの注射と金魚とカットローディング7で観察光受容体の結合の程度を測定するのが比較的正確な手段として、カットローディングを立証する。 カット- Loading技術はまた、網膜で電気シナプスの他のタイプを調査するために使用することができます。例えば、 図 5は、そのウサギ型（ 図5A）およびB型（ 図5B）水平細胞を示して暗順応条件下でneurobiotinの以下のカットローディングと拡散を結合相同トレーサーを示す。 <table border="1"><tbody><tr><td> 化合 </td><td> 魚 </td><td> マウス </td><td> ウサギ </td></tr><tr><td> NaClを</td><td> 130 </td><td> 120 </td><td> 117 </td></tr><tr><td>飽和NaHCO 3 </td><td> 20 </td><td> 25 </td><td> 30 </td></tr><tr><td>のNaH 2 PO 4 </td><td> - </td><td> 1 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> KCL </td><td> 2.5 </td><td> 5 </td><td> 3.1 </td></tr><tr><td>グルコース</td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> MgCl 2の </td><td> 1 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td>し、MgSO 4 · 7H 2 O </td><td> - </td><td> 1 </td><td> 1.2 </td></tr><tr><td>グルタミン</td><td> - </td><td> 0.1 </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> CaCl 2で </td><td> 0.7 </td><td> 2 </td><td> 2 </td></tr></tbody></table> 表1：金魚、マウスおよびウサギ網膜のためのリンガーのソリューションの構成。濃度は、mm単位で表示されます。リンガーのソリューションは、5％CO 2 / 95％O 2でバブリングし、22 ° C（魚）または36 ° C（哺乳類）に維持されています。 " - "：この種のためのリンガーに含まれていない。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図1"> 図1：。カットローディング手順を示すフローチャート。分離O後fは無傷の神経網膜は、いくつかの半径方向のカットは、最初に0.5％neurobiotin溶液に浸漬したブレードによってなされた。網膜は、トレーサーのローディングと拡散インキュベートし、0.1Mリン酸緩衝液（PB）の4％パラホルムアルデヒド（PFA）で固定する前に洗浄した。トレーサーカップリングはAlexa - 488ストレプトアビジンコンジュゲートを使用して検討した。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図2"> 図2：金魚の光受容体トレーサー結合における昼夜の違いは、カットローディング手法によって明らかにされます。光受容体細胞のギャップジャンクションneurobiotinトレーサーの結合は、制御の条件（）で夜間（B）でとペロンの日の次のアプリケーション（10μM）、選択的ドーパミンD 2受容体拮抗剤（C）ではなく、一日で広範囲だ。カット（ACの矢印で示した部分）からの距離の関数としてD）正規化された相対蛍光強度。 E）スペース定数valはDと他の実験（n = 4）のデータから得られたUES。 *** P &lt;0.001。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図3"> 図3。neurobiotinとローダミンデキストランの両方のソリューションでカットのロードを以下の夜間暗順応金魚の網膜の光受容体細胞層に蛍光を示す代表的な例。その高分子量（&gt; 10,000 MW）、カットの近くにのみ標識された細胞によるオープンギャップ結合チャネルを介して拡散しないローダミンデキストラン（赤で表示）、。対照的に、ギャップ結合を介して拡散neurobiotin（緑で表示）とは、遠くのカットから視細胞で見ることができます。カットの位置は、各パネルの矢印で示されます。スケールバー：200μmの。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図4"> 図4。昼夜異なるウサギの網膜で結合光受容体トレーサーのリファレンスがカットローディング手法によって明らかにされます。光受容体細胞のギャップジャンクショ​​ンneurobiotinトレーサーの結合は、制御の条件（）で一日ではないスピペロン（10μM）（C）のアプリケーションは、次の夜（B）で、日中の豊富なだったが、。 ACで、カットの近くにウサギの光受容体の3次元再構成の垂直のビューが表示されます。カットからの距離の関数としてD）正規化された相対蛍光強度。 E）Dと他の実験（n = 3）のデータから得られた空間の定数値は、。 *** P &lt;0.001。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図5"> 図5。カットローディングは、暗順応ウサギ水平細胞はトレーサーが結合されていることを明らかにする。型（）とB型の両方（B）暗順応ウサギの網膜の水平細胞は、相同neurobiotinトレーサーの結合を示した。

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<li>Mills, S. L., Massey, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+biotinylated+tracers+distinguishes+three+types+of+gap+junction+in+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A series of biotinylated tracers distinguishes three types of gap junction in retina.</a> J. Neurosci. 20, 8629-8636 (2000).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここで説明するカットローディング方式は、異なる照明条件下での昼と夜の異なる時期に網膜ニューロン間ギャップ結合のトレーサーの結合の程度を決定するために有用と簡単なテクニックです。この手法の利点は、昼と夜の間に照明の様々な条件の下で無傷の網膜組織の神経細胞間ギャップ結合のトレーサーの結合の程度を定量化するために、小径のsomaの複数形を持つ結合ニューロンのためにそうする機能が含まれています。 2つのカテゴリに無傷の組織の秋にギャップジャンクショ​​ンの研究では手法の限界。最初に、オープンギャップ結合を介してトレーサーの拡散がのために観察することが比較的困難な場合があります）の小径やオープンチャネルと結合し細胞内区画1,14,15のb）の相対的なボリュームに関連付けられている電荷。それは、小セルから結合セルの大きいセルまたはグループ、カンプのトレーサー拡散です大きいセルから小さいセルにトレーサーの拡散にared、トレーサー希釈のために検出するのは難しいかもしれません。第二に、いくつかの生理的条件下では、無傷の組織におけるギャップ結合を介してトレーサーの拡散の程度は正確に比較的大きなトレーサーの浸透性に比べて、小型電気通電イオンの伝導度の違いによるギャップ結合コンダクタンスの強さを反映していない場合があります分子1,14,15。一般的には、トレーサー結合の証拠が強く機能し、オープンギャップ結合チャネルの存在を示唆しているが、一部の生理的条件下では、トレーサーの拡散は、電気生理学的記録が機能し、開いたギャップ結合の存在を示唆していても発生しないことがありますか観察される。 それは、カットローディング技術はまた、中枢神経sysの他の地域からの無傷の組織内のニューロン間ギャップ結合のトレーサーの結合の程度を調査するために使用できる可能性が高いと思わTEM。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（省略可能） </td></tr><tr><td> Tricaineメタンスルホネート（MS222） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A5040 </td><td>バッファリングされた水槽の水の150 mg / Lで</td></tr><tr><td>ウレタン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> U2500 </td><td>を2g / kgloading用量</td></tr><tr><td>デュアルチューブナイトビジョンゴーグル</td><td>夜光学米国</td><td> D - 221 </td><td></td></tr><tr><td>ろ紙、グレード4号</td><td>ワットマン紙</td><td> 1004-090 </td><td></td></tr><tr><td>ファイン鉗子、11センチデュモン5号、Biologie、 </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11295〜10 </td></tr><tr><td>ファインはさみ、ばね式、8ミリブレード、ストレート</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 15025〜10 </td><td></td></tR&gt; <tr><td> Neurobiotin </td><td>ベクトル</td><td> SP - 1120 </td><td> 0.5パーセント</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン結合アレクサ488 </td><td>インビトロジェン</td><td> S11223 </td><td>二パーセント</td></tr><tr><td>デキストランローダミン（高い（&gt; 10,000）MW） </td><td>インビトロジェン</td><td> D1817 </td><td> 0.5パーセント</td></tr><tr><td> Vectashieldマウンティング培地</td><td>ベクトル</td><td> H - 1000 </td><td></td></tr><tr><td>ツァイス510 METAレーザー走査型共焦点顕微鏡</td><td>カールツァイス株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td> LSM - 5画像ブラウザ3,2,0,115 </td><td>カールツァイス株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td> ImageJのソフトウェア</td><td> NIH </td><td></td><td></td></tr><tr><td> OriginPro 8.0 </td><td> OriginLabの（株） </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

カットローディング：網膜ニューロン間ギャップ結合トレーサーカップリングの程度を調べるための便利なツール

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

化学シナプス伝達に加えて、ギャップ結合によって接続されているニューロンは、電気シナプス伝達を介して急速に通信することができます。証拠を増やすと、ギャップ結合だけではなく、電流の流れとの相互接続または結合細胞間の同期活動を許可することを示しているが、結合セル間の強度や電気通信の有効性は、かなりの程度の1,2に変調することができます。さらに、多くのギャップ結合チャネルの大内径（〜1.2 nm）はギャップ結合が、代謝的および化学的コミュニケーションを仲介することができるように、細胞内シグナル伝達分子と相互接続されたセルの間の小さな代謝物の拡散にも電流が流れていないだけを許可しますが、 。ニューロンと神経伝達物質やその他の要因により、その変調の間のギャップ結合コミュニケーションの強さは、同時に電気的に結合細胞から記録することによって、tを決定することにより調べることができる単一細胞へのイオン導入注入後、彼はギャップジャンクショ​​ン透過性であるトレーサー分子の拡散の程度、ではなく、膜透過性、。しかし、これらの手順はそのまま神経組織の小さなsomaの複数形を持つニューロンに対して実行することは極めて困難になる可能性があります。 five網膜ニューロンタイプの各々が電気的ギャップジャンクション3,4によって接続されているため、電気シナプスと電気通信の変調に関する多くの研究は、脊椎動物の網膜で行われている。増加する証拠は、光刺激における網膜と変化の概日（24時間）クロックが3-8結合ギャップ結合を調節することが示されている。例えば、最近の作品は、網膜の概日時計は、ドーパミンD2受容体の活性化を増加させることにより、日中ロッドと錐体視細胞間の結合ギャップ結合を減少させる、そして劇的にD2受容体の活性化を減らすことにより、夜間のロッドコーンカップを増加させることが実証されています<suP&gt; 7,8。しかし、だけでなく、無傷の神経網膜組織の小さなsomaの複数形を持つニューロンに対して実行することは極めて困難なこれらの研究がありますが、それは十分にギャップ結合の光誘起変化を避けるために、単一の網膜神経細胞の電気生理学的研究の間に照明条件を制御することが困難な場合がありますコンダクタンス。 ここで、我々は、異なる照明条件下での昼と夜の異なる時期に網膜ニューロン間ギャップ結合のトレーサーの結合の程度を決定する簡単な方法を提示する。このカットローディング技術は、オープンギャップ結合チャネルを介して色素ローディングと拡散に基づいて9月12日ロードレイプの変更、です。スクレイプのロードは、培養細胞ではなく、そのような無傷の網膜のような厚いスライスでうまく動作します。カットローディング技術がそのまま魚と哺乳類の網膜7、8,13の光受容体の結合を研究するために使用されている、と間の結合を研究するために使用することができますここで説明するように他の網膜神経細胞、。

網膜ニューロン間ギャップ結合のトレーサーの結合の程度を決定するのは簡単で便利な方法が記載されている。このテクニックは1つが異なる照明条件下で、昼夜の別の回で無傷の網膜の神経細胞間の電気シナプスの機能を調べることができます。

化学的なシナプス伝達に加えて、ギャップ結合で接続されたニューロンは、電気的なシナプス伝達を通じて迅速に情報を伝達することもできます。

本カットローディング実験の全体的な目的は、制御された照明条件下において、無傷の網膜内のニューロン間におけるギャップ結合トレーサーカップリングの程度を調べることです。まず、細胞膜は通過せず、開いたギャップ結合チャネルを介して拡散可能なトレーサー分子であるニューロビオチンの溶液に浸した鋭利な刃で網膜を切断します。次に、網膜をリンガー液中でインキュベートし、開いたギャップ結合チャネルを通じてトレーサーを拡散させます。ギャップ結合のカップリングが弱い場合、ニューロビオチンの蛍光は切断部位の近くにある網膜ニューロンに限定されます。対照的に、ギャップ結合のカップリングが強い場合は、切断部位から離れた網膜ニューロンでも蛍光が検出されます。既存の技術と比較してカットローディング（cut loading）の主な利点は、無傷の網膜神経組織において、細胞体が小さいニューロンに対しても容易に実施できる点にあります。また、切片のロード中の照明条件の制御は、無傷の網膜組織における単一ニューロンの電気生理学的研究での制御よりも容易です。電気記録に使用される光刺激自体がギャップ結合のカップリングに変化をもたらす可能性があるため、この手法を実演するのは私の研究室のポストドクターであるDr.Chu Choiです。この手順では、手術前の少なくとも1時間、金魚を日中の完全暗黒下で保持します。また、網膜組織を固定するまでの以降のすべての手順も、日中の完全暗黒下で行います。水槽の水に150 milligrams per literのmethanesulfonateを添加し、金魚を深く麻酔させます。その後、連邦および大学のガイドラインに従って金魚を安楽死させ、眼球を慎重に取り出します。次に、各眼球の前部を取り除きます。続いて、眼球の後部の上にフィルターペーパーを置き、フィルターペーパーと眼球を反転させ、フィルターペーパーが眼球の後部の下にくるようにします。次に、暗順応させたキンギョの眼球から、強膜および色素上皮を含む眼球後部を慎重に取り除きます。細い鋏を用いて、網膜の視神経を切断します。眼球摘出前に、光受容体側を上にして配置したキンギョの神経網膜をフィルターペーパーに固定します。その後、眼球後部から無傷の神経網膜を切り出し、6ウェルプレートの各ウェルに、試験薬の有無にかかわらず、炭酸緩衝リンゲル液で酸素化した5 mLの溶液を加えて麻酔状態で保持します。常暗条件下で、網膜をウェルに転移させます。次に、パラフィルムでウェルを密閉し、組織を30分間インキュベートします。網膜の切断直前に、0.5% neuro biotinをリンガー液に溶解させ、100 µLのトレーサー溶液を調製します。次に、ニューロビオチン溶液をガラス製ペトリ皿に入れます。続いて、網膜が付着しているフィルターペーパーをペーパータオルの上で軽く叩きます。余分なリンガー液を取り除くため、カミソリの刃をニューロビオチン溶液に浸し、網膜とフィルターペーパーを垂直に放射状に切断します。その後、カミソリの刃を再びneuro biotin溶液に浸し、網膜を2回目に切開します。この操作を網膜1個あたり最大4回まで繰り返します。この段階で、網膜を新鮮なリンガー液（試験薬を含む、または含まない培地）に移し、 loadingと拡散のために15分間静置します。新鮮なリンガー液（被験薬を含むか、または含まない培地）で3回、各5分間洗浄します。次に、室温で0.1 Mリン酸緩衝液中の4%パラホルムアルデヒドを用いて、網膜を1時間固定します。その後、網膜を0.1 M PBSで4°Cにて一晩洗浄し、翌日に冷蔵庫から取り出します。0.1 M PBSおよび0.3% Triton X 100を用いて、2% streptavidin Alexa 488を最終濃度10 µg/mLになるように調製し、網膜と反応させ、4°Cで一晩インキュベートします。翌日、室温にて0.1 M PBSで網膜を3回、各回10分間洗浄します。PBSを用いて、フィルターペーパーから網膜を剥離します。次に、細筆を使用して、網膜の光受容体側を上にして、Vector Shield封入剤を塗布したスライドガラス上に固定します。スライドを共焦点レーザー走査顕微鏡に移し、すべての実験条件において同一の倍率、解像度、および設定で撮影し、ギャップ結合による機能性トレーサーの共役範囲に対する異なる実験条件の影響を比較できるようにします。これは、定常暗黒下における日中の光受容体細胞トレーサー結合の範囲を、選択的ドーパミン D2 受容体アンタゴニスト存在下での定常暗黒下における日中と比較したものです。両方の画像において、切断面は左側にあることに注意してください。単一の画像ですべての標識細胞が含まれている場合もありますが、関心領域の Z スタックを収集し、それを提示されたような単一の画像に投影（collapsed）させることを推奨します。Zack（ザック）を順次追っていく際の、光受容体細胞トレーサー結合の範囲がこちらです。この画像では、カミソリによる切断面が右側にあることに注意してください。LSM画像ブラウザでトレーサー結合の範囲を定量化するには、画像を開き、エクスポートをクリックして、画像をTIF 16bit非圧縮ファイルとして保存してください。NIH Image Jソフトウェアを使用して、このTIFF画像にスケールバーを含める必要があります。ホールマウント網膜の低倍率画像から、Alexa 488で標識されたニューロビオチンの蛍光強度を測定します。Image Jソフトウェアを使用してTIFFファイルを開き、スケールバーに対応する直線を描きます。次に、[Analyze]から[Set Scale]を選択し、既知の距離と長さの単位を入力します。次に「OK」をクリックします。これで、蛍光測定値をミリメートルなどの校正済み単位で表示できます。その後、矩形選択ツールを使用して、関心領域を選択します。蛍光のピークが選択範囲の左端に来るように配置してください。右端付近に蛍光信号がないことを確認します。「analyze and plot profile」をクリックし、恒常暗黒下で得られた昼間コントロールデータの解析とプロットを行ってください。左から右に向かって指数関数的に減衰する曲線が表示されます。次に、ポップアップウィンドウのコピーをクリックし、Excelに貼り付けます。これで、切断部位からの距離を示す列と、切断部位からの距離の関数として蛍光強度を示す列の2つの列が作成されます。比較として、日中に定常暗黒下で得られたデータを用いて、上記の手順を繰り返します。spit broが存在する場合、各生の蛍光値を最大蛍光値で除し、相対蛍光強度を算出します。切断部位からの距離と相対蛍光強度に対応する2つの列をコピーし、Originソフトウェアに貼り付けます。これらの手順は、昼間のコントロール群と昼間の刺激群の両方について示されています。この時点でのランデータを、指数関数的減衰の1次関数を用いてフィッティングさせます。T検定またはANOVAを用いて、異なる実験条件下における空間定数の値を比較してください。昼間のコントロール、昼間のpip rone、および夜間のコントロールデータの指数関数および統計解析を比較のために示します。ここでは、カットローディング法により明らかになった、暗適応させたキンギョ網膜における光受容体細胞トレーサーカップリングの程度を、昼間（A）、夜間（B）、および選択的ドパミンD2受容体拮抗剤存在下の昼間に例示しています。比較のため、すべての共焦点画像は同一の設定で撮影されました。このグラフでは、3つの実験条件における蛍光強度が切断部位からの距離の関数としてプロットされ、指数関数によってフィッティングされています。カットローディング法（cut loading technique）を用いて、ここに示されている3つの実験条件における空間定数の値を算出することで、ギャップ結合を介したトレーサーの共役の程度を定量化します。また、カットローディング法は、網膜における他の細胞種間や、他種の電気シナプスの調査にも利用可能です。例えば、これら2つの図は、暗適応条件下において、ウサギのA型およびB型の水平細胞が、カットローディング法によるニューロビオチンの導入と拡散に続き、相同的なトレーサー結合を示すことを例示しています。我々は、昼夜における桿体細胞と錐体細胞間のギャップ結合を介したトレーサー拡散の程度を調べるために、このカットローディング法を用いてきました。さらに、この手法は、他の網膜ニューロン間のトレーサー結合が網膜時計や特定の明暗条件によって制御されているかどうかを判定するためにも利用可能です。また、他の脳領域におけるニューロン間のトレーサカップリングの研究にも使用できます。

cut-loading-useful-tool-for-examining-extent-gap-junction-tracer

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