カットローディング：網膜ニューロン間ギャップ結合トレーサーカップリングの程度を調べるための便利なツール

次のカットローディング実験の全体的な目標は、制御された照明条件下で、無傷の網膜のニューロン間のギャップ結合トレーサー結合の程度を調べることです。最初のステップは、ニューロビオチンの溶液に浸した鋭利な刃物で網膜を切断することで達成されます。これは、オープンギャップ結合チャネルを介して拡散できるが、細胞膜では拡散できないトレーサー分子です。第2ステップでは、網膜をリンガー溶液中でインキュベートし、オープンギャップ結合チャネルを介したトレーサー拡散を可能にします。

ギャップ結合結合が弱い場合、ニューロビオチン蛍光はカットの近くにある網膜ニューロンに制限されます。対照的に、ギャップ結合結合が強い場合、蛍光はカットから遠く離れた網膜ニューロンで検出されます。既存の技術よりも負荷をカットする主な利点は、無傷の神経網膜組織に小さな細胞体を持つニューロンに対して実行しやすいことです。

また、無傷の網膜組織における単一ニューロンの電気生理学的研究よりも、切断負荷中の照明条件を制御する方が簡単です。電気記録中に使用される光刺激は、それ自体がギャップ接合結合の変化につながる可能性があるため、この手法を実証するのは、私の研究室のポスドクであるChu Choi博士です。この手順では、金魚は手術前に少なくとも1時間、日中の一定の暗闇に保たれ、網膜組織が固定されるまでの以下のすべてのステップは、日中も一定の暗闇で行われ、水槽の水に1リットルあたり150ミリグラムのメタンスルホン酸塩を加えることによって金魚に深く麻酔をかけます。

次に、連邦政府と大学のガイドラインに従って金魚を犠牲にし、目玉を慎重に取り除きます。次に、各眼球の前部を切除します。次に、濾紙を目の後部の上に置き、濾紙と目を反転させて、濾紙が目の後部の下にくるようにします。

次に、暗順応金魚から強膜と色素上皮を含む目の後ろをそっと取り除きます。網膜は細いハサミで視神経を切断します。網膜指向の光受容体側を上にした神経金魚は、核摘出前に濾紙に付着する必要がありますが、魚は、無傷の神経網膜を目の後部から解剖した後、6ウェルプレートの各ウェルに試験薬の有無にかかわらず、炭酸塩ベースのリンガー溶液で酸素化された5ミリリットルで麻酔を受けています。

網膜を一定の暗闇の中でウェルに移します。次に、パラフォームでウェルを密封し、組織を30分間インキュベートします。網膜を切断する直前に0.5%ニューロビオチンをリンガー溶液に溶解することにより、100マイクロリットルのトレーサー溶液を調製します。

次に、ガラスのシャーレにニューロビオチン溶液を加えます。次に、網膜を貼り付けている濾紙をペーパータオルで軽くたたいます。余分なリンガーを取り除くには、カミソリの刃をニューロビオチン溶液に浸し、網膜と濾紙に垂直な放射状に切り込み

その後、カミソリの刃を再びニューロビオチン溶液に浸し、網膜をもう一度切断します。これを網膜ごとに最大4つのカットまで繰り返します。このステップでは、網膜を新鮮なリンガーに移し、試験薬の有無にかかわらず15分間培地に移し、ローディングと拡散を可能にします。

試験薬の有無にかかわらず、中程度の新鮮なリンガーでそれぞれ5分間洗浄します。次に、網膜を4%パラホルムアルデヒドで0.1モルリン酸緩衝液に室温で1時間固定します。その後、網膜を0.1モルPBSで摂氏4度で一晩洗い、翌日冷蔵庫に入れます。

網膜を2%ストレプトアビジンAlexa 4 88と0.1モルPBSおよび0.3%Triton X 100で反応させ、最終濃度10マイクログラム/ミリリットルまでし、摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日。網膜を0.1モルPBSで室温で3回、毎回10分間洗浄します。

PBSの濾紙から網膜を切り離します。次に、細いブラシを使用して、網膜光受容体側を上にして、ベクトルシールドマウントメディウム付きのスライドにマウントします。スライドをレーザー走査型共焦点顕微鏡に移し、各実験条件で同じ倍率と設定で写真を撮影することで、異なる実験条件がギャップ機能トレーサー結合の程度に及ぼす影響の比較を示すことができます。

これは、選択的ドーパミンD、2つの受容体拮抗薬の存在下で一定の暗闇で日中と比較して、一定の暗闇での日中の光受容体細胞トレーサーの結合の程度です。両方の画像でカットされたカミソリが左側にあることに注意してください。1 つの画像にラベル付けされたすべてのセルが含まれている場合がありますが、関心領域の Z スタックを収集し、それを 1 つの画像に折りたたむことをお勧めします。

これは、このようなザックを順次移動したときの視細胞トレーサーの結合の程度です。この画像のカミソリの切り口が右側にあることに注意してください。LSMイメージブラウザでトレーサー結合の範囲を定量化するには、イメージを開き、[エクスポート]をクリックして、NIHイメージJソフトウェアを使用してこのTIFFイメージにTIF16ビット非圧縮ファイルスケールバーを含める必要がある画像として保存します。

ホールマウント網膜の低倍率画像から、Alexa 4 88標識ニューロビオチンの蛍光強度を測定します。Image Jソフトウェアを使用してTIFFファイルを開き、スケールバーに対応する直線を描きます。次に、分析に移動し、縮尺を設定して、既知の距離と長さの単位を入力します。

次に、[OK]をクリックします。現在、蛍光測定値は、ミリメートルなどの校正された単位で表示できます。これに続いて、長方形の選択ツールを使用して関心のある領域を選択します。

蛍光のピークは、選択の左端に配置する必要があります。右の境界線付近に蛍光シグナルがないことを確認してください。[解析] をクリックし、一定の暗闇で取得した日中の制御データのプロファイルをプロットします。

指数関数的に減衰する曲線が左から右に表示されます。次に、ポップアップウィンドウで[コピー]をクリックして、Excelに貼り付けます。これで、2つの列があり、1つはカットからの距離を示し、もう1つはカットからの距離の関数としての蛍光強度を示しています。

比較として、上記の手順を日中の一定の暗闇で取得したデータで繰り返します。唾液ブロの存在下で、各生の蛍光値を最大蛍光値で割って、相対的な蛍光強度を求めます。カットからの距離と相対的な蛍光強度に対応する2つのカラムをコピーし、オリジンソフトウェアに貼り付けます。

これらの手順は、昼間の制御と昼間の唾の両方について示されています。この時点での実行データは、結果を指数関数的減衰に適合させます。1つ目は、T検定またはInovaを使用して、さまざまな実験条件での空間定数値を比較することです。

比較のために、昼間制御、昼間ピップロン、夜間制御データの指数関数と統計分析を示します。表示。これは、日中A、夜間B、および日中の選択的ドーパミンDの存在下での暗順適応金魚網膜における光受容体細胞トレーサー結合の程度の例であり、カットローディング技術によって明らかにされた。すべての共焦点画像は、比較のために同じ設定を使用して撮影されました。

このグラフでは、3つの実験条件の蛍光強度がカットからの距離の関数としてプロットされ、指数関数によって適合されています。カットローディング手法は、3つの実験条件についてここに示すように、空間定数値を計算することにより、ギャップ接合トレーサー結合の程度を定量化するために使用されます。カットローディング技術は、網膜の他の細胞タイプと他の種との間の電気シナプスを調査するためにも使用できます。

例えば、これらの2つの図は、ウサギ、A型およびB型の水平細胞が、暗順適応条件下で神経ビオチンの相同トレーサーカップリング、切断負荷、および拡散を示すことを示しています。私たちは、カットローディング技術を使用して、昼夜を問わずロッドとコーンの間のギャップ接合部を介したトレーサーの拡散の程度を調査しました。さらに、この手法は、他の網膜ニューロン間のトレーサー結合が網膜時計によって制御されているかどうか、または特定の明るい暗条件によって制御されるかどうかを判断するために使用できる。

また、他の脳領域のニューロン間のトレーサー結合の研究にも使用できます。